应用甲基化芯片和表达谱芯片筛选过敏性鼻炎差异基因及部分验证

发布时间：2020-05-12 00:03

【摘要】：研究背景过敏性鼻炎(Allergic Rhinitis,AR)是最常见的呼吸道炎症性疾病之一,发病率有逐年上升的趋势,其发病机制尚未完全阐明,无法开发出有效的精准治疗手段。研究表明DNA水平的甲基化改变和RNA水平的基因表达异常可能参与AR的发病过程,因此可以借助高通量基因芯片等技术发现AR患者潜在的致病性基因及甲基化位点,并结合生物信息学方法和生物学手段进行分析和验证,从而为AR的发病机制研究提供新的思路和理论依据。研究方法本研究首先选取AR患者(n=19)和非AR患者(n=11)的下鼻甲黏膜组织,通过全基因组甲基化芯片和全基因组表达谱芯片检测,分别筛选AR患者中出现的异常甲基化位点和差异性表达基因;随后通过Gene Ontology功能富集、KEGG通路富集、联合芯片(甲基化和表达谱)和文献检索等方法对筛选出的基因进行综合分析;最后选取AR患者(n=55)和非AR患者(n=40)的样本,在mRNA水平和蛋白水平对表达谱筛选的部分差异基因进行验证。研究内容和结果甲基化芯片发现,AR患者中出现的异常甲基化位点总共为94个;通过Gene Ontology功能富集、KEGG通路富集和联合表达谱芯片分析均未出现阳性结果,通过文献检索发现TLR6和IL-4R基因的异常甲基化位点可能与AR的发病关系较为密切。表达谱芯片发现,AR患者中出现差异性表达的基因总共为160个;Gene Ontology分析发现32条显著的功能富集,其中20条富集与纤毛结构或功能直接相关;KEGG分析发现8条显著的通路富集,其中1条与纤毛结构直接相关并富集最为显著;文献检索并结合纤毛结构和功能的特点,选取以下纤毛功能(FOXJ1)和纤毛结构相关(DNAI1、DNALI1和DNAH9)的差异性表达基因进行实时荧光定量PCR的验证后,确认了FOXJ1、DNAI1、DNAI1、和DNAH9在AR患者下鼻甲黏膜中表达下降的现象;随后通过免疫荧光染色法对FOXJ1和DNAI1的蛋白水平进行检测和观察,并首次发现和报道了 FOXJ1蛋白的4种定位模式;进一步建立评分机制并结合细胞实验,评价FOXJ1和DNAI1的蛋白定位特点,发现了 AR患者下鼻甲黏膜中出现了显著升高的FOXJ1和DNAI1蛋白的异常定位改变。结论本研究对AR患者下鼻甲黏膜中存在的异常甲基化位点和差异性表达基因进行了筛选,为AR发病机制的研究提供了重要线索;纤毛结构和功能相关基因表达下降、蛋白标志物的异常定位改变是AR患者下鼻甲黏膜中的重要特征,可能与AR的发生发展密切相关,未来需要更深入的机制研究进一步证实;本研究中建立了纤毛标志物蛋白定位评分体系,相信能为相关领域研究者提供重要的参考价值。
【图文】：

过敏原或病原体不能及时地排出，便可引起反复的鼻腔鼻窦炎症［３８］。正常运动逡逑纤毛由纤毛膜、基质和轴丝（Ａｘｏｎｅｍｅ）组成；轴丝的超微结构，呈典型的“９ｘ２＋２”逡逑模型（图３－１，选自我们课题组尚未发表的数据），包括周围９组二联外周微管逡逑（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ），分别称Ａ管和Ｂ管，两者相互间呈紧密连接；相邻的微管之逡逑间由微管连接蛋白（Ｎｅｘｉｎ－ｄｙｎｅｉｎ邋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｎ－ＤＲＣ）相连；从邋Ａ邋管逡逑伸出两条动力臂结构，分别称为外动力臂（Ｏｕｔｅｒ邋ｄｙｎｅｉｎ邋ａｒｍ）和内动力臂（Ｉｎｎｅｒ逡逑ｄｙｎｅｉｎ邋ａｒｍ）；外周微管环绕着两条单独分开的微管结构，为中央微管（Ｃｅｎｔｒａｌ逡逑ｐａｉｒ）。外周微管和中央微管间由放射状的辐条结构（Ｒａｄｉａｌ邋ｓｐｏｋｅ）相连接［３９］。逡逑纤毛的动力臂结构包括动力蛋白重链（Ｄｙｎｅｉｎ邋ａｘｏｎｅｍａｌ邋ｈｅａｖｙ邋ｃｈａｉｎ，ＤＮＡＨ），逡逑动力蛋白中间链（Ｄｙｎｅｉｎ邋ａｘｏｎｅｍａｌ邋ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ邋ｃｈａｉｎ，邋ＤＮＡＩ）和动力蛋白轻链逡逑（Ｄｙｎｅｉｎ邋ａｘｏｎｅｍａｌｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ，，ＤＮＡＬ），这些结构是组成纤毛动力臂的重要成逡逑分蛋白［４（）］

Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑３．３．２．５鼻腔细胞离心涂片样本的制备逡逑１）活检鼻腔下鼻甲组织样本后，通过使用ｌ0ｍｇ邋／邋ｍＬ邋Ｄｉｓｐａｓｅ邋ＩＩ逡逑（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）在邋４°Ｃ过夜，然后在邋３７°Ｃ下用邋１３Ｔｉｔｐ－ｓｐｉｎ／ＥＤＴＡ逡逑处理１５分钟，随后使用ｌｍｌ量程移液器来调整至最大量程后进行吹打，尽可能逡逑将单细胞悬浮液与新鲜鼻活检样品解离；逡逑２）将解离的细胞在室温下４％多聚甲醛固定液中固定１０分钟后离心逡逑（１２００ｒｐｍ，５ｍｉｎ），卩及取上清液后，沉淀中加入ｌｘＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ液缓慢吹打逡逑并静置１０分钟，两次并离心（１２００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）；逡逑３）最后，通过使用细胞离心涂片机【Ｓｈａｎｄｏｎ邋Ｃｙｔｏｓｐｉｎ邋３邋Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ逡逑（Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；邋Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｆｉｓｃｈｅｒ邋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，邋ＭＡ）】，在温和加速下逡逑以５００ｒｐｍ转速５ｍｉｎ制备ｃｙｔｏｓｐｉｎ邋（每张载玻片１－２＞＜１0４个细胞）玻片，锡纸密逡逑闭后保存于－２０°Ｃ冰箱中。逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R765.21

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本文编号：2659280