WWOX基因对鼻咽癌细胞生物学行为的影响及其机制的研究

发布时间：2020-05-15 10:27

【摘要】：目的:探讨WWOX基因在鼻咽癌细胞中的生物学功能及其分子机制。方法:1.设计并包装含WWOX基因片段和空载片段的慢病毒载体。分别将携有WWOX基因片段和空载片段的慢病毒载体通过体外基因转染鼻咽癌细胞株CNE1构建实验组CNE1/WWOX和空载组CNE1/CON,稳定转染后的细胞进行扩增培养。其中以转染空载片段的慢病毒载体(空载组CNE1/CON)及未经转染(空白对照组CNE1)的细胞作为对照。在转染72h后,在倒置荧光显微镜下进行观察、拍照并计算转染效率。借助于实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)分别测定三组细胞中WWOX的mRNA和WWOX蛋白的表达。2.分别用划痕实验和/或Transwell迁移实验以及Transwell侵袭实验研究WWOX过表达对三组细胞迁移及侵袭能力的影响。用RT-PCR检测三组细胞中E-cadherin的mRNA的表达。3.通过平板克隆形成实验、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法来检测三组细胞的生长、增殖能力。用流式细胞仪来检测三组细胞周期的变化及用Annexin V-APC/7-AAD双荧光标记细胞凋亡实验来分别检测三组细胞的细胞凋亡的变化。用Western Blot检测AKT、p-AKT、Caspase-3、CleavedCaspase-3蛋白表达。结果:1.CNE1/CON和CNE1/WWOX的转染效率分别为96.7±0.7%、95.8±1.0%。RT-PCR实验结果显示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中WWOX的mRNA相对表达量分别为1.000±0.001、1.010±0.041和104.691±0.418,实验组较空载组和空白对照组WWOX的mRNA相对表达量明显增高,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot检测结果显示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中WWOX蛋白相对表达量分别为0.151±0.042,0.139±0.10和1.263±0.195,实验组较空载组和空白对照组WWOX的蛋白相对表达量明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。2.划痕实验结果显示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX相对划痕愈合率分别为(55.67±2.08)%、(58.67±1.15)%和(11.67±1.15)%,实验组较空载组和空白对照组相对划痕愈合率明显减小,差异有统计学意义(P0.05)。Transwell迁移实验结果显示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX细胞穿膜数分别为206.8±3.7个,201.4±3.1个和58.8±3.0个,实验组较空载组和空白对照组的细胞穿膜数明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。Transwell侵袭实验结果显示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中细胞穿膜数分别为114.2±8.7个,109.0±5.9个,31.0±2.2个,实验组较空载组和空白对照组的细胞穿膜数明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。RT-PCR检测三组细胞E-cadherin的mRNA表达情况。结果显示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中E-cadherin的mRNA相对表达量分别为1.000±0.000、1.009±0.015和1.393±0.080,实验组较空载组和空白对照组E-cadherin的mRNA相对表达量增加,差异有统计学意义(P0.05)。3.细胞克隆形成实验显示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中细胞克隆形成率分别为(71.9±3.4)%、(70.1%±2.3)%和(27.9%±1.7)%,实验组细胞生长速度较慢,形成的克隆较小,且其克隆形成率明显少于空载组和空白对照组,差异有统计学意义(P0.05)。MTT实验结果显示,实验当天三组细胞OD值差异无统计学意义(P0.05),从第24h开始,实验组OD值明显低于空载组和空白对照组的各时间点,差异有统计学意义(P0.05)。用流式细胞仪检测细胞周期,实验结果显示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中G0/G1期的细胞数分别为(62.31±1.26)%、(59.60±1.87)%和(40.95±2.29)%;CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中G2/M期的细胞数分别为(8.38±0.23)%、(8.88±0.87)%和(22.06±1.34)%;CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中S期的细胞数分别为(29.30±1.48)%、(31.52±1.28)%和(36.99±1.78)%,实验组较空载组和空白对照组G0/G1期的细胞数明显下降,差异有统计学意义(P0.05),实验组较空载组和空白对照组G2/M期的细胞数明显增加,差异有统计学意义(P0.05),而S期在三组细胞中变化不大,差异无统计学意义(P0.05)。3.用Annexin V-APC/7-AAD双染料处理细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验结果显示CNE1、CNE1/CON、CNE1/WWOX细胞凋亡率分别为(4.13±0.10)%、(4.15±0.04)%和(16.54±0.07)%,实验组较空载组和空白对照组的细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot检测AKT、p-AKT蛋白和Caspase3、cleaved-Caspase3蛋白表达水平。实验结果显示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中p-AKT蛋白相对表达量分别为0.842±0.009,0.843±0.010和0.604±0.006,实验组较空载组和空白对照组的p-AKT蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P0.05);然而,三组细胞中AKT的蛋白相对表达量变化不大,差异无统计学意义(P0.05)。CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中Caspase3蛋白相对表达量分别为0.548±0.10,0.546±0.008和0.147±0.06,实验组较空载组和空白对照组Caspase3的蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P0.05)。然而,三组细胞中的cleaved-Caspase3蛋白相对表达量分别为0.285±0.008,0.287±0.007和0.533±0.004,实验组较空载组和空白对照组cleaved-Caspase3蛋白相对表达量增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.成功构建WWOX过表达稳定的实验组CNE1/WWOX细胞株和空载组CNE1/CON细胞株。2.WWOX过表达可使E-cadherin表达上调,抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力。3.WWOX过表达可明显抑制鼻咽癌细胞生长、增殖能力。WWOX过表达可能是通过诱导细胞周期阻滞在G2/M期,从而抑制鼻咽癌细胞增殖。WWOX过表达可能通过激活AKT使p-AKT(Ser473)的蛋白表达水平下调或/和通过激活caspase-3,使cleaved-Caspase3蛋白表达水平上调,从而促进鼻咽癌细胞CNE1的细胞凋亡。
【图文】：

图 1-2 RT-PCR 检测三组细胞中 WWOX 的 mRNA 表达情况 The mRNA expression of WWOX in three groups of cells was detected by RT-PCR. **P<0.01; ***P<0.001）印迹（Western blot）检测WWOX蛋白表达水平的变化慢病毒转染后，，Western blot结果显示 CNE1、CNE1/CON和WOX中WWOX蛋白相对表达量分别为0.151 ± 0.042，0.13 ± 0.195。实验组较空载组和空白对照组中WWOX蛋白表达水 <0.05)，见图1-3。从蛋白水平说明细胞转染后，成功构建稳定细胞株。

图2-1 WWOX对鼻咽癌细胞CNE1相对愈合能力的影响（×200）e 2-1. Effect ofWWOX on the relative healing ability of nasopharyngeal carcinoma cell CNE1. （*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001）（×200）WWOX基因后鼻咽癌CNE1细胞迁移能力的变化ranswell迁移实验结果显示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中细胞分别为206.8±3.7个、 201.4±3.1个和58.8±3.0个。实验组的细数较空载组和空白对照组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05),如Transwell迁移实验与划痕实验的结果相一致，进一步说明WWOX基达可明显抑制鼻咽癌CNE1细胞的迁移能力。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.63

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