纤维连接蛋白1对鼻咽癌的迁移侵袭、凋亡的影响及其机制研究

发布时间：2020-06-10 15:18

【摘要】：一、研究意义鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是头颈部的常见肿瘤,它的分布具有明显的区域性,尤其是在我国南方地区,是发病率比较高的恶性肿瘤之一[1]。虽然,放射治疗是治疗鼻咽癌的主要手段,但是这只能对早期和分化程度比较好的鼻咽癌,这类患者经过放射治疗其5年生存期可以达到90%以上;对于中晚期的患者,单纯使用放射治疗效果并不好,其中远处转移以及局部复发率比较高,是导致治疗效果不好的主要原因,也是患者的主要死因。因此,探索以及阐明导致鼻咽癌局部复发及转移的可能机制,寻找有效的分子治疗靶点,有助于寻求有效的鼻咽癌治疗策略以改善患者的预后和延长患者的无病生存期。纤维链接蛋白1(Fibronectin1,FN1)是一种重要的细胞外基质蛋白(extracellular matrix,ECM)分子。参与细胞粘附和迁移过程,包括胚胎发生,伤口愈合,凝血,宿主防御和转移[2]。文献报道称:FN1的过表达是口腔鳞状细胞癌和甲状腺癌的一个不良信号[3,4]。它是头颈鳞状细胞癌放射抗性的潜在生物标志物。当出现铂类抗药性时,其在卵巢癌中的表达出现明显的升高[5,6]。同时FN1在乳腺癌细胞和间质中的表达可以明显高于癌旁腺上皮以及间质[7]。近期研究表明,FN1在鼻咽癌组织中的表达明显高于癌旁组织,并且和鼻咽癌的分期,转移以及生存期呈负相关[8]。虽然有学者对FN1在鼻咽癌中的表达进行了报道,但是仅仅是做了差异表达的分析,未对FN1在鼻咽癌中迁移侵袭及凋亡的作用进行探讨,同时其机制更是不明确的,所以本课题旨在对FN1在鼻咽癌细胞的迁移侵袭以及凋亡中的作用以及其发生机制进行探讨。希望我们的研究可以为将来的临床应用提高有效的参考。二、研究目的探讨FN1在鼻咽癌细胞增殖、粘附、迁移、侵袭以及凋亡的影响。为逆转鼻咽癌的恶性生物行为,丰富鼻咽癌的治疗策略提供理论基础。三、研究方法1.我们从GEO数据库中下载GENE数据,这些组织的载入数为GSE12452,从GSM312896到GSM312905为正常的健康鼻咽组织,GSM 312906为GSM 312936为鼻咽癌组织。用于分析的芯片为Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0阵列,平台为GPL570。为了使数据更容易分析和获得高质量的基因,我们使用数据标准化的中值方法。设置基因过滤器为:(1)探针的基因表达不低于中位数的3倍,变化应大于总样本的20%。(2)缺失值应小于基因表达值的50%。(3)如果与几个探针相对应的基因,则只保留最高的IQR。最后,我们发现FN1明显上调,折叠变化为9.12。2.细胞培养将鼻咽癌细胞株5-8F和C666-1细胞置于37℃,含5%浓度的C02,相对湿度为50%的细胞培养箱内培养,用含10%胎牛血清的RPMI-1640和高糖DMEM细胞培养基进行培养。3.细胞生物学实验1)慢病毒转染鼻咽癌细胞株5-8F和C666-1,干扰FN1基因的表达;2)荧光定量PCR检测FN1的干扰情况;3)免疫印迹(western blot)检测鼻咽癌细胞株的FN1的干扰情况;4)细胞划痕实验和迁移、侵袭(transwell实验)实验检测FN1基因对细胞迁移能力的变化的影响;5)细胞粘附实验检测FN1对细胞粘附能力和迁移侵袭的影响;6)细胞增殖实验及克隆形成实验检测FN1对鼻咽癌细胞增殖能力的影响;7)细胞凋亡TUNEL实验以及流式实验检测细胞凋亡情况的变化;8)裸鼠皮下成瘤实验9)数据分析四、研究结果1.转染效率的检测用针对FN1基因的慢病毒进行稳定转染,下调鼻咽癌细胞中FN1的表达,用实时定量Q-PCR和蛋白免疫印迹检测FN1蛋白表达明显降低。2.划痕愈合实验和迁移侵袭实验检验各组细胞的迁移能力划痕愈合实验表明:下调了 FN1的细胞组鼻咽癌细胞的划痕愈合能力明显降低,和对照组相比干扰组的划痕宽度明显宽一些。每组之间的差异具有统计学意义。Transwell实验表明:下调了 FN1的鼻咽癌细胞和对照组相比,迁移侵袭能力明显降低,穿过小室的细胞数明显减少。3.细胞功能学检测鼻咽癌细胞的恶性行为细胞功能实验表明:在下调了 FN1的表达以后,细胞的增殖能力、粘附能力,增殖能力均出现了明显的降低;克隆形成数明显少于对照组。细胞的凋亡率明显增加。差异具有统计学意义。4.下调FN1对鼻咽癌细胞在裸鼠皮下成瘤能力的影响。小鼠肿瘤生长速度:在下调了 FN1基因表达的组中,肿瘤体积小于对照组,生长速度明显减慢。5.Western blot 检测细胞中 MMP9、MMP2、BCL2、Caspase3 的表达情况蛋白印迹结果显示:下调了 FN1以后,与肿瘤迁移侵袭相关的蛋白MMP9和MMP2出现了明显的降低。和凋亡相关的蛋白BCL2的表达降低,Caspase3的表达出现了明显升高。同时NF-kB通路上的基因在FN1的调节通路中出现了明显的改变。差异具有统计学意义。五、研究结论1.FN1在鼻咽癌中呈现过度表达状态。2.下调了 FN1的表达可以抑制鼻咽癌细胞的迁移侵袭并且可以降低迁移侵袭相关蛋白MMP2和MMP9的表达;3.下调了 FN1的表达可抑制裸鼠的皮下肿瘤的生长速度和体积,可以通过上调BCL2,下调Caspase3,来抑制NPC细胞的凋亡;4.NF-kB/P65通路参与FN1对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的调控,在下调了 FN1的表达的基础上激活NF/kB的表达可以抑制细胞的凋亡,可能NF-kB/P65通路在FN1对鼻咽癌细胞的凋亡调控中发挥着重要作用。综上所述,我们的研究的创新点主要是指明了 FN1是鼻咽癌细胞迁移侵袭增殖的促进因素,是凋亡的抑制因素,并且其对凋亡的抑制主要是通过NF-kB通路来起作用的。所以下调了 FN1的表达可能对鼻咽癌细胞的恶性生物学行为起到一定的调控作用,从而为鼻咽癌的治疗提供一个新的方向。
【图文】：

愈合能力,细胞,划痕

逡逑图３．２．２．基因ＦＮ１下调效率的验证。Ａ和Ｂ是ＲＮＡ水平上的下调效率的验证。Ｃ和Ｄ逡逑是蛋白水平的下调效率的验证。无论在ＲＮＡ邋７］Ｃ平还是蛋白水平ＦＮ１在５－８Ｆ和Ｃ６６６－１细胞逡逑中的下调效果都很明显（Ｐ＜0．0５）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２．２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ邋ｏｆ邋ＦＮ１邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．邋Ａｆｔｅｒ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ邋ｗｉｔｈ邋ｓｈＦＮｌ邋３６ｈ逡逑ｌａｔｅｒ，ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｗａｓ邋ｏｂｖｉｏｕｓ邋ｂｙ邋ｑＰＣＲ邋ｉｎ邋Ｃ６６６－１邋（Ａ）邋ａｎｄ邋５－８Ｆ邋ｃｅｌｌｓ邋（Ｂ）．邋Ｔｈｅ邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋ｒｅｓｕｌｔｓ逡逑ｓｈｏｗｅｄ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ＦＮ１邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋（Ｃ邋ａｎｄ邋Ｄ）．ＧＡＰＤＨ邋ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ａｓ邋ａ邋ｌｏａｄｉｎｇ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋＊Ｐ＜０．０５，逡逑＊＊Ｐ＜０．０１．逡逑３．３邋ＦＮ１明显抑制鼻咽癌细胞的迁移侵袭能力逡逑３．３．１划痕实验证实下调了邋ＦＮ１细胞的迁移能力明显下降逡逑根据前边所述的方法对细胞进行划痕创口的制造，在第２４小时，３０小时的逡逑时候分别对细胞愈合能力进行拍照并记录细胞愈合能力的变化。实验结果表明，，逡逑在不同的时间点，对鼻咽癌细胞的ＦＮ１基因进行下调以后划痕愈合能力明显比逡逑对照组减弱了，并且差异具有统计学意义。逡逑表３．３：下调了邋ＦＮ１的表达，５－８Ｆ和Ｃ６６６－１细胞中划痕愈合能力的变化逡逑Ｔａｂｌｅ邋３．３：邋Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ邋ｗｉｔｈ邋ＦＮ１邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

鼻咽癌细胞,细胞,细胞系,愈合能力

逦＇１１＇°￣邋Ｈｉ邋ｐ逡逑■W 邋Ｊ＾。．５．邋Ｉｐａｌ逡逑＾ＫＢＫｉ逦ＯＨ邋２４Ｈ逦３０Ｈ逡逑图３．３邋ＦＮｌ对细胞愈合能力的影响。通过细胞划痕实验来验证ＦＮｌ对细胞伤口愈合能逡逑力的影响。在５－８Ｆ细胞系中观察了邋１２小时，我们发现到１２小时时对照组细胞己经出现了逡逑明显的愈合，而ｓｈＦＮｌ组中，细胞的愈合不明显（图Ａ）。在Ｃ６６６－１细胞系中，在对照组ＮＣ逡逑组中２４，小时、３０小时时，细胞均出现了比较明显的愈合，和下调组之间有明显的差异（图逡逑Ｂ）。（Ｐ＜０．０５）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．３邋．ＥｆＴｅｃｔ邋ｏｆ邋ＦＮ１邋ｏｎ邋ｃｅｌｌ邋ｈｅａｌｉｎｇ邋ａｂｉｌｉｔｙ．邋Ｔｌｉｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＦＮ１邋ｏｎ邋ｗｏｕｎｄ邋ｈｅａｌｉｎｇ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌｓ逡逑ｗａｓ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ｃｅｌｌ邋ｓｃｒａｔｃｈ邋ａｓｓａｙ．邋Ａｆｔｅｒ邋１２邋ｈｏｕｒｓ邋ｏｆ邋ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋５－８Ｆ邋ｃｅｌｌ邋ｌｉｌｉｅｓ，邋ｗｅ邋ｆｏｕｎｄ邋ｔｈａｔ逡逑ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｈｅａｌｉｎｇ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｈａｄ邋ｏｃｃｕｒｒｅｄ邋ａｔ邋１２邋ｈｏｕｒｓ，邋ｂｕｔ邋ｎｏｔ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｈＦＮｌ逡逑２６逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.63

【参考文献】