肌节同源盒蛋白同系物2（Msx2）对小鼠晶状体早期形态发育的转录调控作用

发布时间：2020-06-18 12:11

【摘要】：目的:肌节同源盒基因同系物2(Muscle Segment Homeobox,Homolog of,2,Msx2)位于5号染色体长臂5q34-q35,编码由263个氨基酸组成的蛋白质,它可以与核心转录复合物作用调节转录。以往研究多集中在Msx2对颅骨、乳腺等组织发育的影响上,但最新研究发现Msx2基因表达异常可影响晶状体发育,导致小眼球畸形等多种先天性眼病。晶状体作为眼屈光间质,具有屈光和调节的功能,实验证明在小鼠围产期移除晶状体会导致眼前节多组织发育障碍,晶状体功能不良也可直接导致视网膜等眼组织发育障碍,说明晶状体的发育在眼组织发育过程中所起的作用至关重要。晶状体形态发生可分三个阶段,包括晶状体的诱导和决定、晶状体形态发生及晶状体细胞分化。脊椎动物的晶状体来源于头部的表皮外胚层,最早的形态学表现是形成晶状体基板。晶状体基板是与视泡相邻的表皮外胚层增厚的区域,在视泡从前脑突出并与表皮外胚层紧密接触之后才形成晶状体基板。视泡与晶状体基板之间的相互作用很强,并有细胞质外延介导。在胚胎发育第10天,晶状体基板和视泡的外层内陷,形成晶状体凹和视杯。胚胎发育第11天,晶状体凹在表面外胚层闭合形成晶状体泡。在这个时期,晶状体凹面向视网膜一侧的上皮细胞开始增厚,晶状体泡后部的上皮细胞向前延伸分化成晶状体纤维细胞。多年来国内外学者对晶状体发育过程以及其调控机制进行了大量研究。现阶段对于晶状体发育过程的调控,国内外学者主要从信号传导通路和转录调控两方面进行研究:1)信号传导通路:目前研究认为晶状体发育过程涉及BMP、FGF及Wnt等多种信号传导通路,对晶状体的发育起重要作用;2)转录调控:晶状体调节基因(Pax6,Meis,Six3等)和结构基因(Crystallins,MIP/aquaporin0等)的转录调控与晶状体发育全过程直接相关,在晶状体发育过程中形成不同时期不同位置的转录调控网络,是晶状体发育过程中最重要的调控途径。任何晶状体调节基因和结构基因的调控出现异常,都会导致晶状体发育异常。晶状体细胞凋亡是白内障发生的机制之一,最近研究发现Msx2表达异常可以影响晶状体发育过程,导致晶状体发育障碍。但Msx2作为新发现的眼部发育调控基因,其在眼部发育过程中的具体功能及作用机理尚不清楚。本研究利用Msx2cko小鼠,通过观察其晶状体发育过程的变化,探讨Msx2基因表达缺失对晶状体早期发育的影响。方法:1、组织学方法制备发育E9.5至E12.5天的胚胎及P21眼球石蜡切片,常规苏木素-伊红染色(HE染色)观察Msx2cko小鼠晶状体发育形态的变化。2、免疫组化分析常规免疫荧光方法观察,Msx2cko小鼠晶状体谱系特定转录因子Pax6,Sox2,Ap2α及Prox1的表达强度变化。3、BrdU免疫组化分析BrdU标记母鼠,制备胚胎发育E10.5石蜡切片,免疫组织化学方法观察Msx2cko小鼠与Msx2~(flox/flox)小鼠晶状体内BrdU标记细胞的变化。4、Tunel细胞凋亡检测利用Tunel方法检测Msx2cko小鼠胚胎发育E10.5晶状体组织细胞凋亡,染色步骤按说明书进行,光镜下,按照凋亡细胞的特异性荧光染色判断凋亡细胞。5、LacZ染色观察Le-Cre重组酶在发育中的晶状体组织中特异性表达。用Le-Cre转基因小鼠与ROSA26R小鼠交配,取发育至E10.5,E13.5胚胎,在4%PFA中固定10分钟,PBS洗3次,在X-gal染色液中4℃过夜。6、整胚原位分子杂交观察Msx2cko小鼠胚胎晶状体内Msx2、Sox2、FoxE3的转录变化。以含有RNA聚合酶启动子的cDNA质粒为模板,利用RNA聚合酶转录生成RNA探针。取发育至E9.5-E12.5天小鼠胚胎,整胚原位分子杂交观察Msx2cko小鼠晶状体内Msx2、Sox2、FoxE3的转录变化。7、基因芯片分析及实时定量PCR验证应用上海伯豪生物技术有限公司提供的小鼠全基因组芯片,筛选Msx2cko和Msx2~(flox/flox) P1小鼠(n=3)晶状体组织差异表达基因,并进行GO和KEGG分析差异基因。对差异表达基因进行GO分析筛选出凋亡相关基因,并取Msx2cko和Msx2~flox/floxlox/flox P1小鼠晶状体组织RT-PCR进行基因芯片验证。结果:从E10.5天开始,Msx2cko小鼠的晶状体发育过程与Msx2~(flox/flox)小鼠相比受到抑制,表现为晶状体泡发育位置正常但体积变小。至E12.5天,Msx2cko小鼠晶状体上皮细胞分化不明显,晶状体明显减小,并且晶状体与角膜粘连,不分离。晶状体与视网膜之间有神经鞘细胞长入。在胚胎发育第10.5天,Msx2cko小鼠与Msx2~(flox/flox)小鼠相比,BrdU标记细胞无明显差异,但是凋亡细胞明显增多。整胚原位分子杂交技术观察到在胚胎E10.5天时,Msx2cko小鼠的晶状体中可观察到FoxE3在晶状体内表达水平下降,至E12.5天,FoxE3的表达完全缺失,而Msx2~(flox/flox)小鼠中FoxE3在胚胎E10.5-11.5天的晶状体前部上皮细胞中明显表达。其他晶状体发育过程中关键的转录调控因子Pax6、Sox2、Ap2α的表达在Msx2cko小鼠及Msx2~(flox/flox)小鼠中无差异、β晶体蛋白作为晶状体发育的结构蛋白,在两种小鼠中的表达无明显差异。在Msx2cko P1小鼠中Caspase-3和Caspase-8表达增加。结论:1、Msx2cko小鼠晶状体发育异常,表现为小晶状体,晶状体与角膜组织分离迟缓。2、Msx2cko小鼠晶状体细胞增殖不受影响,但凋亡增加,且Caspase-3和Caspase-8在Msx2cko小鼠晶状体中表达增加,可能导致晶状体发育迟缓的原因。3、Msx2基因敲除后通过抑制FoxE3基因的表达来调控晶状体发育,Msx2不仅参与晶状体发育的转录调控,而且在转录调控网络中处于上游位置,在晶状体发育过程中起到重要的作用。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R77
【图文】：

Cre 重组酶的启动子为 Pax6 的 Le-Cre 转基因小鼠基因型用 PCR 方法来鉴定（图1b）。用 Le-Cre 转基因小鼠与 ROSA 报到小鼠交配，利用 LacZ 染色方法进行检测，结果显示Cre重组酶在发育中的晶状体组织中特异性表达(图1cE10.5 图1dE13.5)。此外，利用整胚原位杂交技术观察到在胚胎 E9.5 天时，Msx2mRNA 在 Msx2cko和Msx2flox/flox小鼠胚胎视泡中都有表达(图2a，2b)；胚胎E10.5天开始，Msx2mRNA在 Msx2flox/flox小鼠胚胎视泡中表达，Msx2 mRNA 在 Msx2cko 小鼠胚胎视泡中的表达完全缺失，证明 Msx2 基因在这一时期已经失去功能(2c，2d)；在胚胎 E11.5 天时

和Msx2flox/flox小鼠胚胎视泡中都有表达(图2a，2b)；胚胎E10.5天开始，Msx2mRNA在 Msx2flox/flox小鼠胚胎视泡中表达，Msx2 mRNA 在 Msx2cko 小鼠胚胎视泡中的表达完全缺失，证明 Msx2 基因在这一时期已经失去功能(2c，2d)；在胚胎 E11.5 天时，Msx2 mRNA 在 Msx2flox/flox小鼠胚胎晶状体泡中表达，Msx2 mRNA 在 Msx2cko 小鼠胚胎晶状体泡中表达缺失（图 2e

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本文编号：2719212