PNUTS基因对喉癌Hep-2细胞增殖侵袭的影响

发布时间：2020-06-22 11:19

【摘要】：目的研究PNUTS基因对人喉癌Hep-2细胞增殖、侵袭转移和上皮间质化的影响,并初步探讨其中可能的调控机制,以期为临床上喉癌的治疗提供新的靶点及理论依据。方法1.PNUTS基因siRNA重组腺病毒(Ad-siPNUTS)的构建、最适MOI的筛选及效果鉴定(1)不同MOI值的腺病毒感染Hep-2细胞,以感染效率达80%以上为最适MOI。(2)RT-PCR 及 Western Blotting 检测 Ad-siPNUTS 对 Hep-2 细胞PNUT mRNA和蛋白表达的影响。2.Ad-siPNUTS对喉癌细胞Hep-2生物学功能的影响(1)MTT法检测Hep-2细胞增殖能力;(2)Transwell法检测Hep-2细胞迁移、侵袭能力;(3)Western Blotting 检测 Hep-2 细胞中 EMT 相关表型 E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达。3.PNUTS调控Hep-2细胞的机制Western Blotting 检测 PI3K、P-AKT、Rb 总蛋白、p-Rb、E2F1、ZEB1的表达。结果1.成功构建靶向PNUTS基因的siRNA重组腺病毒Ad-siPNUTS;MOI值为100时感染效率达80%以上;RT-PCR及Western Blotting检测结果表明,Ad-siPNUTS感染喉癌细胞Hep-2后,PNUTSmRNA及蛋白表达水平显著降低(P0.05);2.MTT实验表明:Ad-siPNUTS感染Hep-2细胞后,与阴性对照组(Ad-GFP)相比,实验组(Ad-siPNUTS)细胞增殖速度在第2(P=0.004)、3(=0.001)、4天(P=0.000)明显减慢;阴性对照组(Ad-GFP)与空白对照组(PBS)相比差异无统计学意义(P0.05);3.Transwell迁移实验表明:Ad-siPNUTS感染Hep-2细胞后,与Ad-GFP组相比,Ad-siPNUTS组细胞迁移能力显著下降(P=0.000),Ad-GFP组与PBS组差异无统计学意义(P=0.372);4.Transwell侵袭实验表明:Ad-siPNUTS感染Hep-2细胞后,与Ad-GFP组相比,Ad-siPNUTS组细胞侵袭能力显著下降(P=0.000);Ad-GFP组与PBS组差异无统计学意义(p=0.420);5 Western Blotting检测结果表明,Ad-siPNUTS感染Hep-2细胞后,与 Ad-GFP 组相比,Ad-siPNUTS 组 E-cadherin(P=0.003)表达升高,总Rb(P=0.000)、p-Rb(P=0.000)、PI3K(P=0.023)、p-AKT(P=0.000)、N-cadherin(P=0.005)、ZEB1(P=0.000)、E2F1(P=0.000)表达降低;Ad-GFP组与PBS组差异无统计学意义。结论1.靶向PNUTS基因的siRNA重组腺病毒载体可高效并特异性沉默PNUTS基因的表达。2.重组腺病毒载体Ad-siPNUTS可抑制喉癌细胞Hep-2的增殖、侵袭转移及EMT的发生。3.PNUTS 对 Hep-2 细胞的调控可能与 PI3K/AKT、Rb/E2F1、Rb/ZEB1信号通路有关。4.PNUTS基因可能是喉癌基因治疗的新靶点。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.65
【图文】：

２．３邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ对Ｈｅｐ－２细胞生物学行为的影响逡逑２．３．１邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ对Ｈｅｐ－２细胞增殖能力的影响逡逑Ｈｅｐ－２细胞生长曲线（图３）显示：与Ａｄ－ＧＦＰ组相比，Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ组中Ｈｅｐ－２逡逑细胞生长速度在第２天日（ｉＭ）．００４）、第３天日００．００１）、第４天日００．０００）逡逑明显减慢，差异具有统计学意义；Ａｄ－ＧＦＰ组和ＰＢＳ组比较差异无统计学意义。逡逑１＇５＇逦ＰＢＳ逡逑－ｍ－邋Ａｄ－ＧＦＰ逡逑１0逦－ｔ－邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ逡逑°邋°－５－邋＾逡逑ｏ．0Ｊ—ｉ逦１逦１逦１—逡逑Ｎ逦＜Ｖ逦ｆｃ－逡逑时间（ｄ）逡逑图３邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ对Ｈｅｐ－２细跑增殖的影响逡逑Ｆｉｇ邋３邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ邋ｏｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｈｅｐ－２邋ｃｅｌｌｓ逡逑？Ｐ＝０．００４

逑２．３．２逦Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ对Ｈｅｐ－２细胞迁移能力的影响逡逑Ｔａｎｓｗｅｌｌ迁移实验结果（图４）显示：ＰＢＳ组、Ａｄ－ＧＦＰ组及Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ组逡逑的细胞穿膜数分别为（３４３．００＋４．０１）个，（３３９．００＋７．５５）个，（１２５．３３＋２．０８）个；逡逑与Ａｄ－ＧＦＰ组相比，Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ组细胞穿膜数明显下降，差异有统计学意义逡逑（Ｐ＝０．０００）邋；邋Ａｄ－ＧＦＰ与ＰＢＳ组差异无统计学意义００．３７２）。逡逑麟Ｉ逦＿栜＿＾｜邋：？、：娭２逡逑焌舰？：：馨怼逡逑．ＰＢＳ．组逦Ａｄ－ＧＦＰ．组逦Ａｄ－ｓｉＭＯＴＳｌＲ，逡逑图４邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ对Ｈｅｐ－２细胞迁移能力的影响（结晶紫染色ｘ２００）逡逑Ｆｉｇ邋４邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ邋ｏｎ邋ｍｉｇｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｈｅｐ－２邋ｃｅｌｌｓ邋（邋ｘ２００）逡逑Ｐ＝０．０００，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｇｒｏｕｐ邋Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ邋ａｎｄ邋ｇｒｏｕｐ邋Ａｄ－ＧＦＰ逡逑２．３．３逦Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ对Ｈｅｐ－２细胞侵袭能力的影响逡逑Ｔａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验结果（图５）显示：ＰＢＳ组、Ａｄ－ＧＦＰ组及Ａｄ－ｓｉＰＮＵＴＳ组逡逑的细胞穿膜数分别为（３２５．６７＋４．１６）个，（３２２．３３＋３．２１）个，（８８．０１＋６．２５）个；逡逑Ａｄ－ＧＦＰ组相比

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 何正波;陈斌;冯国忠;;昆虫RNAi技术及其应用[J];昆虫知识;2009年04期

本文编号：2725607