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microRNA-194-5p靶向SMURF1调控mTOR信号通路影响下咽癌增殖转移的机制研究

发布时间:2020-07-09 08:10
【摘要】:目的:下咽癌(Hypopharyngeal carcinoma)是下咽区域主要的恶性肿瘤,占所有头颈部恶性肿瘤的1.4%至5.0%,占全身恶性肿瘤的0.5%。其特点是发病部位较隐匿,患者预后较差。下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)具有局部侵袭性生长及粘膜下浸润的特点,并且易淋巴结转移,甚至远处转移。有50%的病例,在就诊时出现颈部淋巴结转移。因此,在下咽癌的治疗上,为了能做到早发现早诊断早治疗,提高患者的生存率,我们迫切的需要探究下咽癌的分子生物基础,寻找其发生发展、侵袭转移的机制,找到针对下咽癌的靶向治疗方法,这些都是具有十分重要意义的。Micro-RNAs(miRNA)是一类广泛存在于真核细胞生物中,序列高度保守,调节基因表达的非蛋白编码RNAs。研究表明,micro RNA可以充当致癌基因和(或)抑癌基因的角色。microRNA可以通过同时靶向调控几种mRNA来协调复杂呈网络的肿瘤内部分子蛋白机制。在头颈肿瘤系统中,口腔鳞癌、舌鳞癌、喉鳞癌、鼻咽癌均有报道miRNA具有差异化的表达。但相比其他头颈肿瘤,针对下咽癌开展的miRNAs的研究却不多。如果我们能找到具有代表性的miRNAs,建立与下咽癌分子机制间的关系,就将对下咽癌的发生发展侵袭转移等机制的研究做出重要贡献。材料与方法:H-E染色确认术中收集的组织标本,免疫组化染色检测下咽癌组织中SMURF1的阳性表达情况。生物信息学预测网站预测SMURF1与miR-194-5p的靶向关系,双荧光素酶报告基因实验证实。Real-Time PCR及western blot检测下咽癌组织中miR-194-5p、SMURF1的表达情况。人咽鳞癌细胞系FaDu细胞培养、观察及传代。miR-194-5p模拟物及阴性对照、miR-194-5p抑制剂及阴性对照分别转染FaDu细胞。利用CCK-8及Transwell检测各转染组细胞增殖和侵袭的变化。Real-Time PCR、Western blot检测转染以上转染各组SMURF1 m RNA和蛋白的表达变化。再向各组加入m TOR信号通路的特异性抑制剂雷帕霉素后,观察mTOR、p-mTOR的表达变化情况。CCK-8及Transwell检测各组FaDu细胞增殖和侵袭能力的变化。si RNA干扰瞬时沉默SMURF1后,观察p-m TOR的蛋白表达变化。所有数据以平均值±标准差(MEAN±STDEV)来表示,采用SPSS17.0版本进行统计分析,采用独立样本t检验与配对t检验进行组间的比较分析,miR-194-5p与临床病理特征之间的组间比较采用χ~2检验,miR-194-5p与SMURF1之间的比较采用Spearman相关分析,*P0.05、**P0.01代表具有显著性差异。实验结果:1.下咽癌临床标本的H-E染色H-E染色下,下咽癌组织细胞排列紊乱,细胞核比例大染色深,上皮细胞内可见癌巢,形成的鳞状上皮细胞团块.2.下咽癌组织标本中miR-194-5p的表达水平Real-time PCR实验证实与癌旁正常组织相比,miR-194-5p在癌组织中的表达下调,miR-194-5p的表达量的高低与年龄、性别因素无明显相关性。但与原发肿瘤范围的分期(T)及区域淋巴结转移的存在与否及范围(N)具有相关性。3.miR-194-5p对FaDu细胞增殖和侵袭能力的影响miR-194-5p表达上调后,FaDu细胞的增殖能力下降,侵袭细胞数目减少;miR-194-5p表达下调后,FaDu细胞的增殖能力提高,侵袭细胞数目增多,证明miR-194-5p负向调控FaDu细胞的增殖和侵袭。4.下咽癌组织标本中SMURF1的表达水平对标本行免疫组化染色发现,SMURF1在癌组织中的免疫反应阳性率高于癌旁。Real-time PCR、Western Blot也证实,在癌组织中SMURF1mRNA和蛋白水平表达上调,而在癌旁正常组织中表达下调。统计分析与miR-194-5p的表达呈负相关。5.双荧光素酶报告基因检测miR-194-5p与SMURF1之间具有靶向关系SMURF1-wtUTR与hsa-miR-194-5p mimic共转染FaDu细胞,与对照组相比,荧光活性明显下降,证明SMURF1与miR-194-5p靶向结合。6.过表达或低表达miR-194-5p后,SMURF1表达的变化SMURF1的表达在miR-194-5pmimic组被抑制,在miR-194-5pinhbitor组被上调。7.各转染组加入雷帕霉素后mTOR及p-m TOR蛋白表达的变化miR-194-5p mimic+雷帕霉素组的p-mTOR表达量显著减少,说明miR-194-5p的过表达下调了p-mTOR,与抑制剂雷帕霉素具有协同作用。miR-194-5p inhbitor+雷帕霉素组的p-mTOR含量有明显回升,虽未达到miR-194-5p inhbitor组水平,但与单独加入雷帕霉素组相比,提高明显,说明miR-194-5p的低表达敏感突出地调控了p-mTOR的含量,即使加入专一特异的抑制剂雷帕霉素,也只能部分削弱部分影响,反面证明了mTOR通路受miR-194-5p的调控。8.miR-194-5p调控mTOR信号通路对下咽癌FaDu细胞增殖和侵袭能力的影响过表达miR-194-5p与抑制mTOR信号通路有协同共促进作用,对FaDu细胞增殖与侵袭的抑制作用比单独转染mimic或单独加入抑制剂更为显著。miR-194-5p inhbitor+雷帕霉素组的Fa Du细胞增殖能力,与单独加入雷帕霉素组相比,有明显提高,但未达到mi R-194-5pinhbitor水平,说明雷帕霉素对于mTOR通路的抑制作用不足以完全拮抗miR-194-5p低表达导致的mTOR信号通路激活对FaDu细胞增殖和侵袭的上调作用。也证明了mTOR通路受miR-194-5p的调控。9.FaDu细胞转染SMURF1 siRNA后,p-mTOR表达变化“沉默”了SMURF1,p-mTOR的表达明显减少,证明了SMURF1表达下调导致p-mTOR蛋白表达量减少,抑制了mTOR信号通路的活性。结论:1.下咽癌组织及细胞系中miR-194-5p低表达,其靶蛋白SMURF1高表达。2.miR-194-5p靶向结合SMURF1,当miR-194-5p过表达时,SMURF1下调,下咽癌细胞增殖及侵袭受到抑制。3.miR-194-5p靶向SMURF1调控mTOR信号通路,当mi R-194-5p低表达,SMURF1表达上调,mTOR信号通路激活,反之,miR-194-5p高表达,SMURF1表达下调,mTOR信号通路受到抑制。本研究为探究下咽癌特异性的肿瘤标记物,寻找可靠的靶向治疗提供新的思路。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R739.63
【图文】:

下咽癌


中国医科大学博士学位论文3 结果3.1 下咽癌临床标本的 H&E 染色结果H&E 染色下,下咽癌组织中:细胞排列紊乱,细胞核比例大染色细胞内可见癌巢,形成的鳞状上皮细胞团块,向真皮浸润,棘细胞呈条状细胞团瘤性增生,部分可见角化癌珠,周围淋巴细胞、浆细胞浸润。组织:细胞排列较整齐,形态清楚,轮廓清晰,细胞核染色较浅(图

表达水平,下咽癌


1-2 Real-time PCR 检测 30 对临床样本中 miR-194-5p 的表达水平miR-194-5p 的表达水平显著低于癌旁正常组织(**P<0.01)。下咽癌组织标本中 miR-194-5p 的表达水平与下咽癌 TNM系临床患者资料整理,进一步地探讨 miR-194-5p 的表达与下咽癌病之间的关系,以 miR-194-5p 表达的中位数 1.126(2-△△Ct均值的中位值将 miR-194-5p 的表达量分为相对低表达和相对高表达,分94-5p 与下咽癌患者年龄、性别、TNM 分期间的关系。结果证实:miR量的高低与年龄、性别因素无明显相关性。但与原发肿瘤范围的分淋巴结转移的存在与否及范围(N)具有相关性,差异具有显著性(*P1-4)。

过表达,转染,实验组,细胞


图1-3 miR-194-5p mimic转染FaDu细胞后的表达情况,,实验组miR表达量明显升高,实现了 miR-194-5p 的过表达(**P<0.01).4.1 CCK-8 实验检测 miR-194-5p 对 FaDu 细胞增殖能力的影响miR-194-5p 表达上调后,对 FaDu 细胞的增殖有抑制作用,iR-194-5pmimic 在 48h、72h、96h 这三个时间点,与空白对照组及阴性比,明显降低了 FaDu 细胞的增殖能力,差异具有统计学意义(**P<0.iR-194-5p 表达下调后,对 FaDu 细胞的增殖有促进作用,当 FaDu 细胞iR-194-5pinhbitor 后,在 24h、48h、72h、96h 这四个时间点,与空白对性对照组相比,FaDu 细胞的增殖能力明显增强,差异具有统计学意义(*P<0.01)(表 1-6,图 1-4)。表 1-6 CCK-8 检测不同时间点各转染组吸光度 OD 值时间点 MEAN±STDEVp

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本文编号:2747193

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