miR-184抑制视网膜母细胞瘤机制研究和土家族先天性无虹膜家系PAX6基因突变位点分析
发布时间：2020-07-10 17:08
【摘要】：第一部分:miR-184在视网膜母细胞瘤中的表达和作用目的:检测miR-184在正常视网膜组织与视网膜母细胞瘤(RB)组织中的表达差异,并通过合成miR-184抑制剂和模拟剂检测miR-184对RB细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞侵袭和迁移的影响。方法:利用实时荧光定量PCR方法检测5名手术患者RB组织与正常视网膜组织、RB细胞系中(Y79细胞和WERI-RB-1细胞)miR-184表达差异,应用统计学分析,对比正常视网膜组织与RB组织中的表达差异;参考国内外对WERI-RB-1细胞的复苏培养方法,通过将WERI-RB-1细胞复苏、传代将状态良好的对数生长期WERI-RB-1细胞分为六组:正常对照组、空白脂质体对照组、miR-184 mimic NC 组、miR-184 mimic 组、miR-184 inhibitor NC 组和 miR-184 inhibitor组。然后将miR-184模拟剂和miR-184抑制剂分别转染到miR-184 mimic组、miR-184 inhibitor组中,应用Trizol法提取RNA,使用逆转录试剂盒合成cDNA,应用实时荧光定量PCR方法检测miR-184的表达,验证miR-184模拟剂和抑制剂对miR-184的表达差异是否有统计学意义,以检验miR-184模拟剂和抑制剂的有效性,实验重复三次。将人RB细胞株WERI-RB-1细胞分为分为六组:正常对照组、空白脂质体对照组、miR-184 mimics NC组、miR-184 mimics组、miR-184 inhibitor NC组和miR-184 inhibitor组,CCK-8法检测转染48h后的细胞增殖抑制率,AnnexinV和7-AAD染色并用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,Transwell法检测细胞的侵袭和迁移。通过单因素方差分析比较各组数据。结果:通过对比正常视网膜组织、RB细胞系和RB组织之间的表达差异发现:与正常组织相比,miR-184在RB细胞(Y79细胞和WERI-RB-1细胞)和RB组织中的表达显著下调。通过转染实验证实miR-184模拟剂和抑制剂可分别上调(p0.05)和下调(p0.05)miR-184的表达(p0.05)。CCK8检测细胞增殖证实:与阴性空白对照组(0%)、脂质体对照组(0.25%)、miR184mimicNC对照组(2.57%)相比,miR184mimic转染组(23.69%)对WERI-RB-1细胞增殖的抑制率明显提高,miR184 inhibitor显著促进WERI-RB-1细胞增殖(-12.61%),差异具有显著的统计学意义(p0.01),而阴性空白对照组、脂质体对照组、miR184 mimicNC对照组之间差异并无统计学意义(p0.05)。通过PI染色检测细胞周期发现:miR-184mimic处理后RB细胞G0/G1期比例显著增加,S期比例显著降低,而G2/M期比例无显著改变,miR-184可将RB细胞周期阻滞于G1期(p0.01)。凋亡检测发现,miR-184主要诱导RB细胞早期凋亡,对晚期凋亡和坏死影响不明显。miR-184 mimic组早期调亡阳性率为17.25%,明显高于空白对照组(6.50%)、空脂质体组(7.37%)、miR-184 mimic NC 对照组(7.37%)、miR-184 inhibitor NC 对照组(6.62%),而 miR184 inhibitor 转染组则显著降低(3.40%),差异具有统计学意义(P0.05),空脂质体组、阴性miRNA对照组与空白对照组之间差异无统计学意义(P0.05)。Transwell实验证实miR-184对WERI-RB-1细胞的侵袭与迁移也具有显著的抑制作用。结论:miR-184在RB组织及细胞中较在正常视网膜组织中下调。建立了miR-184模拟剂和抑制剂转染的WERI-RB-1细胞瞬时表达模型,并证实miR-184能抑制视网膜母细胞瘤WERI-RB-1细胞的迁移、侵袭和增殖,诱导RB细胞凋亡。miR-184可能是RB治疗的潜在手段。第二部分:miR-184通过靶向SLC7A5调控视网膜母细胞瘤生物学行为研究目的:研究miR-184调控视网膜母细胞瘤细胞的机制,并验证miR-184与SLC7A5表达的关系。方法:多种miRNA靶向数据库搜索miR-184靶向调控基因,韦恩图交叉分析筛选miR-184潜在调控基因;用qRT-PCR和western blotting法检测miR-184抑制剂和模拟剂处理后潜在基因mRNA的表达差异,进而明确miR-184影响最明显的潜在基因。培养人视网膜母细胞瘤细胞株WERI-RB-1后,将实验对象为分为六组:正常对照组、空白脂质体对照组、miR-184 mimicsNC组、miR-184 mimics 组、miR-184 inhibitor NC 组和 miR-184 inhibitor 组。qRT-PCR 分析SLC7A5的mRNA的水平;Western blotting检测SLC7A5蛋白的表达水平。构建pMIR-REPORT-SLC7A5 3-UTR荧光素酶质粒。荧光素酶活性检测法检测miR-184和野生型SLC7A5R3-UTR与靶位点单独突变(Mut1、Mut2、Mut3)之间的相互作用,各组数据的比较采用单因素方差分析。构建SLC7A5过表达质粒(pcMV6-SLC7A5),分组为:miR-184 mimic NC、miR-184 mimic、miR184 mimic+pcMV6、miR184mimic+pcMV6-SLC7A5,检测 miR-184 靶向 SLC7A5 对WERI-RB-1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结果:通过多种miRNA靶向基因数据库交叉分析筛选出miR-184潜在调控的2个基因:TNP02和SLC7A5,其中miR-184与SLC7A5有三个识别位点。miR-184对SLC7A5和TNP02 mRNA表达均有抑制作用,且对SLC7A5的抑制作用更明显(p0.05 =;荧光素酶实验证实miR184主要通过靶向SLC7A5 mRNA 3'UTR区2494-2513区域下调SLC7A5 mRNA和蛋白表达。细胞增殖实验显示不同分组细胞增殖的抑制率分别为:miR-184 mimicNC(2.1%)、miR-184 mimic(16.2%)、miR184mimic+pcMV6(14.8%)、miR184mimic+pcMV6-SLC7A5(2.4%),结果显示过表达SLC7A5蛋白后能拮抗miR-184对WERI-RB-1细胞的增殖抑制作用,差异具有显著的统计学意义(p0.01);细胞凋亡实验显示不同分组细胞的细胞凋亡率分别为:miR-184 mimic NC(7.8%)、miR-184 mimic(17.3%)、miR184 mimic+pcMV6(16.9%)、miR184 mimic+pcMV6-SLC7A5(8.2%),结果显示过表达SLC7A5蛋白后能拮抗miR-184对WERI-RB-1细胞凋亡促进的作用,差异具有显著的统计学意义(p0.01);与miR-184 mimic NC组相比,Transwell实验显示细胞迁移百分数分别为:miR-184 mimic(57.9%)、miR-184 mimic+pcMV6(61.8%)、miR184mimic+pcMV6-SLC7A5(95.6%),结果显示过表达SLC7A5蛋白后能拮抗miR-184对WERI-RB-1细胞的迁移能力的抑制作用,差异具有显著的统计学意义(p0.01);细胞侵袭百分率分别为:miR-184 mimic(27.3%)、miR184 mimic+pcMV6(33.3%)、miR184 mimic+pcMV6-SLC7A5(93.1%),结果显示过表达 SLC7A5 蛋白能拮抗 miR-184对WERI-RB-1细胞迁移的抑制作用,差异具有显著的统计学意义(p0.01)。结论:SLC7A5蛋白能促进WERI-RB-1细胞的增殖和抑制细胞凋亡的作用,并能促进WERI-RB-1细胞的侵袭和迁移能力。与miR-184作用相反,SLC7A5蛋白能拮抗miR-184对WERI-RB-1细胞的迁、侵袭和增殖的抑制和凋亡的促进移作用。结合荧光素酶实验证明miR-184可通过靶向SLC7A5对RB发挥抑制作用。第三部分土家族中一个先天性无虹膜家系的临床特点和PAX6基因突变位点分析目的:确认土家族中一个先天性无虹膜家系的PAX6基因致病突变并分析其临床特点。方法:对该家系中所有成员7人进行详细的眼部检查,采集所有家系成员及100名(50例土家族50例汉族)正常对照组的外周静脉血,提取DNA;对先证者PAX6基因的全部外显子进行PCR扩增及测序;对家系中所有成员和正常对照组进行PAX6基因突变位点的验证检测。结果:该家系主要以虹膜缺损、白内障、眼球震颤、黄斑中心凹发育不良和角膜炎为主要临床表现,虹膜缺损轻重不一,角膜炎和白内障情况随年龄增加而加重;该家系中1男3女共4例患者均在第外显子3与内含子3交界处出现一个杂合突变(c.357+1GA),正常成员及对照组均无此突变。结论:该家系临床表现大体一致,虹膜缺损程度不一;PAX6是该家系的致病基因,(c.357+1GA)突变在我国土家族中未曾报道。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.7;R773.1
【图文】：
对照组（Ｎｔ，邋Ｎ２）视网膜组织中ｍｉＲ－１８４的表达差明显。ＲＢ患者（Ｐｉ－Ｐｓ）与健逡逑康对照组（凡，Ｎ２）相比ｍｉＲ－１８４的表达明显下调，差异具有统计学意义（ｐ＜逡逑０．０５）（图１Ａ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ法检测视网膜母细胞瘤细胞系（Ｙ７９，ＷＥＲＩ－ＲＢ－１）与逡逑正常视网膜细胞（ｎｏｒｍａｌ邋ｒｅｔｉｎａｌ）中ｍｉＲ－１８４的表达差异。结果显示视网膜母细逡逑胞瘤细胞系（Ｙ７９，ＷＥＲＩ－ＲＢ－１）与正常视网膜细胞（ｎｏｒｍａｌ邋ｒｅｔｉｎａｌ）相比ｍｉＲ－１８４逡逑的表达明显下调，差异具有统计学意义（ｐ＜０．０５＝（图ＩＢ）逡逑Ｐ：（ＲＢ邋ｔｉｓｓｕｆｔｓ）逡逑Ｎｒｉｒｃｄｎａｔ邋ｉｓｓｕｅｓ）逡逑Ａ逦逦Ｂ逡逑４．０－
达的成熟ｍｉＲ－１８４相比对照组显著增加，且差异具有统计学意义（ｐ＜０．０５）。逡逑而阴性空白对照组、脂质体对照组、ｍｉＲ－１８４邋ｍｉｍｉｃｓ邋ＮＣ对照组之间差异无统计逡逑学意义（ｐ＞0．0５）（图２Ａ，２Ｃ）。而ｍｉＲ－１８４抑制剂则显著降低ＷＥＲＩ－ＲＢ－１逡逑细胞ｍｉＲ－１８４的表达：通过与阴性空白对照组（１．００±０．０１）、脂质体对照组逡逑（１．２１±０．３８）、ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＮＣ邋对照组（１．２２±０．２４）相比，ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑转染组（０．５９±０．１８）所表达的成熟ｍｉＲ－１８４相比对照组显著降低，且差异具有统逡逑计学意义（ｐ＜0．0５），阴性空白对照组、脂质体对照组、ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＮＣ逡逑对照组之间差异无统计学意义（ｐ＞0．0５）（图２Ｂ，邋２Ｃ）。逡逑Ａ逦Ｂ邋ｉ．５ｌ逦Ｃ邋１0１逦甲逡逑Ｉ：邋ｒｉｌｒｌｉｌｉｌｌ邋：逡逑！２邋°ｉｌ邋Ｈｉｉ邋１１邋＿［逡逑图２邋Ａ：各组ＷＥＲＪ－ＲＢ－ｌ细胞转染模拟剂４８ｈ后成熟ｍｉＲ－１８４表达情况。Ｂ：ｑＲＴ－ＰＣＲ法验证逡逑ＷＥＲＩ－ＲＢ－１邋细胞转染模拟剂邋ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋４８ｈ邋后，成熟邋ｍｉＲ－１８４邋表达情况。Ｃ：邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋法逡逑验证ＷＥＲＩ－ＲＢ－１细胞转染模拟剂与抑制剂４８ｈ后ｍｉＲ－１８４表达综合对比逡逑３．３邋ＣＣＫ８法验证ｍｉＲ－１８４模拟剂和抑制剂对ＷＥＲＩ－ＲＢ－１细胞X椫车腻义嫌跋戾义衔徊矫魅罚恚椋遥保福炊裕遥孪赴挠跋
本文编号：2749210
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.7;R773.1
【图文】：
对照组（Ｎｔ，邋Ｎ２）视网膜组织中ｍｉＲ－１８４的表达差明显。ＲＢ患者（Ｐｉ－Ｐｓ）与健逡逑康对照组（凡，Ｎ２）相比ｍｉＲ－１８４的表达明显下调，差异具有统计学意义（ｐ＜逡逑０．０５）（图１Ａ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ法检测视网膜母细胞瘤细胞系（Ｙ７９，ＷＥＲＩ－ＲＢ－１）与逡逑正常视网膜细胞（ｎｏｒｍａｌ邋ｒｅｔｉｎａｌ）中ｍｉＲ－１８４的表达差异。结果显示视网膜母细逡逑胞瘤细胞系（Ｙ７９，ＷＥＲＩ－ＲＢ－１）与正常视网膜细胞（ｎｏｒｍａｌ邋ｒｅｔｉｎａｌ）相比ｍｉＲ－１８４逡逑的表达明显下调，差异具有统计学意义（ｐ＜０．０５＝（图ＩＢ）逡逑Ｐ：（ＲＢ邋ｔｉｓｓｕｆｔｓ）逡逑Ｎｒｉｒｃｄｎａｔ邋ｉｓｓｕｅｓ）逡逑Ａ逦逦Ｂ逡逑４．０－
达的成熟ｍｉＲ－１８４相比对照组显著增加，且差异具有统计学意义（ｐ＜０．０５）。逡逑而阴性空白对照组、脂质体对照组、ｍｉＲ－１８４邋ｍｉｍｉｃｓ邋ＮＣ对照组之间差异无统计逡逑学意义（ｐ＞0．0５）（图２Ａ，２Ｃ）。而ｍｉＲ－１８４抑制剂则显著降低ＷＥＲＩ－ＲＢ－１逡逑细胞ｍｉＲ－１８４的表达：通过与阴性空白对照组（１．００±０．０１）、脂质体对照组逡逑（１．２１±０．３８）、ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＮＣ邋对照组（１．２２±０．２４）相比，ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑转染组（０．５９±０．１８）所表达的成熟ｍｉＲ－１８４相比对照组显著降低，且差异具有统逡逑计学意义（ｐ＜0．0５），阴性空白对照组、脂质体对照组、ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＮＣ逡逑对照组之间差异无统计学意义（ｐ＞0．0５）（图２Ｂ，邋２Ｃ）。逡逑Ａ逦Ｂ邋ｉ．５ｌ逦Ｃ邋１0１逦甲逡逑Ｉ：邋ｒｉｌｒｌｉｌｉｌｌ邋：逡逑！２邋°ｉｌ邋Ｈｉｉ邋１１邋＿［逡逑图２邋Ａ：各组ＷＥＲＪ－ＲＢ－ｌ细胞转染模拟剂４８ｈ后成熟ｍｉＲ－１８４表达情况。Ｂ：ｑＲＴ－ＰＣＲ法验证逡逑ＷＥＲＩ－ＲＢ－１邋细胞转染模拟剂邋ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋４８ｈ邋后，成熟邋ｍｉＲ－１８４邋表达情况。Ｃ：邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋法逡逑验证ＷＥＲＩ－ＲＢ－１细胞转染模拟剂与抑制剂４８ｈ后ｍｉＲ－１８４表达综合对比逡逑３．３邋ＣＣＫ８法验证ｍｉＲ－１８４模拟剂和抑制剂对ＷＥＲＩ－ＲＢ－１细胞X椫车腻义嫌跋戾义衔徊矫魅罚恚椋遥保福炊裕遥孪赴挠跋
本文编号：2749210
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