光诱导视网膜变性猪模型移植治疗中活体鉴定的初步研究

发布时间：2020-07-11 03:19

【摘要】：目的：用可见光诱导的方法建立广西巴马小型猪视网膜变性(Retinal Degeneration，RD)模型，探索活体对猪形态和功能学进行检测的方法并与离体组织学检测手段一起对该模型进行鉴定。然后，初步探索将人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cell，hESC)诱导分化的视网膜色素上皮细胞(Retinal Pigment Epithelium，RPE)移植到光诱导视网膜变性猪视网膜下腔的手术方法，通过活体检测方法观察细胞移植术后的安全性、移植细胞和猪视网膜的形态和功能学变化，为干细胞移植治疗视网膜变性疾病最终进入临床奠定基础。方法： 1.光诱导广西巴马小型猪视网膜变性模型的建立与鉴定采用白色荧光灯持续间断光照猪3个月以上，诱导猪发生视网膜变性，运用活体形态检测方法-视网膜光学相干断层扫描(Optical Coherence Tomography，OCT)以及活体功能学检测技术-全视野视网膜电图(full-field Eletroretinography，fERG)和多焦视网膜电图(multifocal Electroretinography，mfERG)，对猪视网膜进行鉴定，并与视网膜组织切片HE染色和视网膜透射电镜进行比较分析。 2.初步探索光变性猪行hESC来源的RPE细胞视网膜下腔移植的手术方法、及光变性猪术后的活体形态和功能学检测探索改良hESC-RPE细胞悬液视网膜下腔移植的手术方法，在术后利用活体检测方法如检眼镜、视网膜B超、视网膜OCT、fERG、mfERG、等手段观察移植细胞在光诱导视网膜变性猪视网膜下腔的存活、迁移、整合能力和术后猪视网膜功能的变化。结果： 1.光诱导广西巴马小型猪视网膜变性模型的建立与鉴定与光照前相比，持续间断光照2-4月龄小型猪3-6月后，视网膜OCT检查可见光变性猪视网膜全层(内界膜Inner Limiting Membrane至RPE层)厚度显著变薄；fERG检测发现光变性猪在暗适应最大混合反应的a、b波振幅和ops波振幅显著下降，明适应反应的b波及p1波振幅也有显著下降；mfERG检测发现光变性猪视条纹区P1波平均振幅密度显著降低。这都提示视网膜结构和功能发生了明显改变。视网膜OCT显示的外核层(Outer nuclear layer，ONL)厚度与离体视网膜石蜡切片HE染色显示的外核层厚度均明显变薄，说明了视网膜感光细胞发生了损伤，活体OCT结果与离体组织检测结果一致；视网膜透射电镜发现感光细胞内节线粒体肿胀、嵴断裂、空泡样变，外节膜盘结构破坏，视网膜色素上皮细胞微绒毛结构破坏，进一步表明视网膜感光细胞发生了损伤，从超微结构层面验证了活体检测方法的准确性。 2.光变性猪行hESC-RPE细胞视网膜下腔移植手术、及光变性猪术后的活体形态和功能学检测在本研究中，共对4头光诱导视网膜变性猪探索进行了hESC-RPE细胞悬液视网膜下腔移植术。第1批移植了1头猪，在术后2周行检眼镜和视网膜B超检查示并发性白内障。换用手术显微镜及移植器械、改变手术方法后在第2批移植了3头猪；术后2周行检眼镜、B超检查示无白内障、视网膜脱离等并发症出现；术后1月时的视网膜OCT检查示hESC-RPE细胞进入光变性猪视网膜下腔，移植细胞能够存活，未见排斥反应；术后1月的fERG检查示视网膜整体功能无明显变化；术后1月mfERG检查示0号猪移植区平均振幅密度高于对侧伪手术眼，1号猪移植区平均振幅密度与对侧伪手术眼无明显差异，2号猪移植区平均振幅密度高于对侧未手术眼。结论： 1.与光照前相比，可见光光照广西巴马小型猪3个月以上，通过活体形态学检测(OCT)、功能学(fERG、mfERG)检测和离体组织学检测(石蜡切片、透射电镜)发现猪视网膜形态和功能均有显著变化，表明光诱导视网膜变性小型猪模型建立成功。 2.构建了活体对大动物进行形态和功能学检测的平台，通过对比活体OCT与离体组织切片对光变性猪进行形态学分析，均提示外核层变薄，说明活体OCT与离体组织学结果一致，利用活体OCT对组织学进行观测具有可靠性；同时发现活体OCT对光变性猪的形态学检测结果与活体fERG和mfERG的功能学检测结果是一致的，表明其具有一定的相关性。 3.探索建立了hESC-RPE细胞悬液移植到猪视网膜下腔的手术方法，改进手术设备和方法后的3头猪移植术后早期无并发症发生，安全性较好。 4.光诱导视网膜变性猪行hESC-RPE细胞视网膜下腔移植术后1月时,活体形态学检测(OCT)显示移植细胞在变性猪视网膜下腔存活，无明显的排斥反应发生；活体功能学(fERG、mfERG)检测显示hESC-RPE视网膜下腔移植术后早期对猪视网膜整体功能无明显影响，但是在移植区局部有2头猪出现多焦视网膜功能的提高。表明手术对光变性猪视网膜整体功能无明显影响，hESC-RPE细胞移植可能会改善移植区局部视网膜功能。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R774.13;R-332
【图文】：

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图 2-1 小型猪及光诱导造模室概况A：广西巴马小型猪；B：光诱导造模室(温度 10-25℃，光强 2500lux)2.3.2 .光诱导视网膜变性猪模型的活体鉴定结果2.3.2.1 光诱导前后眼底视网膜照相的比较为了观察光照前与光照后眼底有无异常表现，我们共对 7 头猪 14 只眼全部光诱导前及光诱导后的同一部位的眼底照相。可见光诱导后小型猪眼底照相图诱导前眼底照相图片相比，未见明显的渗出、出血、萎缩等异常表现(图 2-2.A说明了视网膜无肉眼可见的损伤。

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图 2-1 小型猪及光诱导造模室概况A：广西巴马小型猪；B：光诱导造模室(温度 10-25℃，光强 2500lux)2.3.2 .光诱导视网膜变性猪模型的活体鉴定结果2.3.2.1 光诱导前后眼底视网膜照相的比较为了观察光照前与光照后眼底有无异常表现，我们共对 7 头猪 14 只眼全部进导前及光诱导后的同一部位的眼底照相。可见光诱导后小型猪眼底照相图片前眼底照相图片相比，未见明显的渗出、出血、萎缩等异常表现(图 2-2.A，了视网膜无肉眼可见的损伤。

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17图 2-3.2 号猪左眼光诱导造模前后后极部视网膜 OCT 扫描诱导前视网膜图像；B：光诱导 3M 后视网膜图像。C.D：光照前后视网膜各层断层L:脉络膜血管层，RPE:色素上皮层，IS/OS:感光细胞内外节带，ONL：外核层， I GCL：节细胞层，NFL：神经纤维层。肉眼可见造模后猪视网膜反射强度普遍降低状层最明显，IS/OS 和 RPE 反射带间断出现小的低反射区

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