乙酰胆碱酯酶调控糖尿病视网膜病变炎症反应分子机制的研究

发布时间：2020-07-15 07:02

【摘要】：目的:探讨AChE是否调控糖尿病视网膜病变炎症反应,并探索其调控的分子机制。方法:(1)本实验通过雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病动物模型(DM)并通过标准饲料中添加AChE抑制剂多奈哌齐干预处理。实验分为Vehicle+Non-DM组、Vehicle+DM组、Donepezil+Non-DM组、Donepezil+DM组。Western Blot测定各组视网膜ICAM-1、Albumin、ZO-1的表达,免疫荧光技术检测各组中ICAM-1、GFAP、VEGF表达,刀豆凝集素灌注法检测视网膜血管白细胞粘附,视网膜染色铺片检测视网膜上紧密连接蛋白Claudin5表达情况。同时采用AChE基因缺陷小鼠建立DM动物模型,实验分为AChE+/++Non-DM组、AChE+/++DM组、AChE+/-+Non-DM组、AChE+/-+DM组,Western Blot测定各组视网膜ICAM-1、ZO-1的表达,免疫荧光技术检测各实验组视网膜上ICAM-1、GFAP、VEGF表达,伊文思蓝血管通透性分析检测各组小鼠视网膜血管渗漏程度,视网膜染色铺片检测紧密连接蛋白Claudin5表达情况。(2)建立DM动物模型,含多奈哌齐的标准饲料喂养糖尿病小鼠。Western Blot测定各组视网膜NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,免疫荧光技术检测各实验组视网膜上Caspase-1的表达。(3)进一步,采用Caspase-1基因缺陷小鼠建立DM动物模型,Western Blot测定各组视网膜IL-1β、ICAM-1、GFAP、Albumin的表达,刀豆凝集素灌注法检测视网膜血管白细胞粘附。结果:(1)AChE明显上调糖尿病小鼠视网膜ICAM-1、Albumin、ZO-1、VEGF的表达,增加DM组视网膜白细胞粘附及血管渗漏,激活视网膜胶质细胞,并且这些能被AChE抑制剂多奈哌齐以及基因敲除AChE所逆转。(2)DM组视网膜NLRP3、Caspase1、IL-1β的表达较Non-DM组明显上调,且多奈哌齐抑制AChE表达后以上检测指标较DM组降低。(3)基因敲除Caspase-1表达可逆转DM组小鼠视网膜上IL-1β、ICAM-1、GFAP、Albumin的升高,降低视网膜白细胞粘附。结论:这些结果表明,AChE可调控糖尿病小鼠视网膜炎症反应,其机制可能是通过激活NLRP3-Caspase-1炎症小体实现的,为今后更好地治疗DR奠定新的理论基础和提供新的药物靶点。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R774.1
【图文】：

柱形图,白细胞粘附,多奈哌齐,糖尿病小鼠

18图 3.1 多奈哌齐降低糖尿病小鼠视网膜 ICAM-1 表达及血管处白细胞粘附（A 图：WesternBlot 检测 Non-DM 组、DM 组 AChE 表达水平，β-actin 作为内参。实验至少重复三次，利用 T 检验进行统计分析，绘制柱形图（n=3，**P<0.01）。B 图：Western Blot 检测Vehicle+Non-DM 组、Vehicle+DM 组、Donepezil+Non-DM 组、Donepezil+DM 组 ICAM-1 表达水平，β-actin 作为内参。实验至少重复三次，利用 T 检验进行统计分析，绘制柱形图（n=3，**P<0.01， P<0.01）。C 图：Scale bar=50μm，免疫荧光检测 Vehicle+Non-DM 组、Vehicle+DM组、Donepezil+Non-DM 组、Donepezil+DM 组的 ICAM-1 表达情况，红色荧光标记 ICAM-1，蓝色荧光标记细胞核。D 图：Leukostasis 检测 Vehicle+Non-DM 组、Vehicle+DM 组、Donepezil+Non-DM 组、Donepezil+DM 组视网膜血管白细胞粘附情况，箭头所指为淤滞及粘附的白细胞，实验至少重复三次，利用 T 检验进行统计分析，绘制柱形图（n=3，**P<0.01， P<0.01）。）

柱形图,蓝色荧光,多奈哌齐,糖尿病小鼠

20图 3.2 多奈哌齐减轻糖尿病小鼠视网膜神经及血管病变（A 图：Scale bar=50μm，免疫荧光检测 Vehicle+Non-DM 组、Vehicle+DM 组、Donepezil+Non-DM 组、Donepezil+DM 组的GFAP 表达情况，红色荧光标记 GFAP，蓝色荧光标记细胞核。B 图：Scale bar=50μm，免疫荧光检测 Vehicle+Non-DM 组、Vehicle+DM 组、Donepezil+Non-DM 组、Donepezil+DM组的 VEGF 表达情况，红色荧光标记 VEGF，蓝色荧光标记细胞核。C 图：Western Blot检测各组视网膜 Albumin 表达水平，β-actin 作为内参。实验至少重复三次，利用 T 检验进行统计分析，绘制柱形图（n=3，**P<0.01， P<0.01）。D 图：视网膜染色铺片检测各组视

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图 3. 3 AChE 基因敲除糖尿病小鼠视网膜炎症因子 ICAM-1 表达下调（A 图：WesterBlot 检测 AChE+/+ +Non-DM 组、AChE+/+ +DM 组、AChE+/- +Non-DM 组、AChE+/- +DM组的 ICAM-1 表达水平，β-actin 作为内参。实验至少重复三次，利用 T 检验进行统计分析绘制柱形图（n=3，**P<0.01， P<0.01）。C 图：Scale bar=50μm，免疫荧光检测 AChE+/+Non-DM 组、AChE+/+ +DM 组、AChE+/- +Non-DM 组、AChE+/- +DM 组的 ICAM-1 表达情况，红色荧光标记 ICAM-1，蓝色荧光标记细胞核。）3.4AChE 基因敲除糖尿病小鼠视网膜神经及血管病变减轻此部分通过免疫荧光检测糖尿病小鼠中 GFAP 表达，实验分为 AChE+/+Non-DM 组、AChE+/+ +DM 组、AChE+/- +Non-DM 组、AChE+/- +DM 组，实验结果如图所示：A 图： AChE+/+ +DM 组较 AChE+/+ +Non-DM 组小鼠视网膜的 GFAP 表达上调，且 AChE+/- +DM 组小鼠 GFAP 表达较 AChE+/+ +DM 组小鼠视网膜降低，GFAP 为红色荧光。同时我们通过免疫荧光染色及伊文思蓝血管通透性分析检测视网膜 VEGF 表达和血管渗漏改变，实验结果如图所示：B 图AChE+/+ +DM 组较 AChE+/+ +Non-DM 组小鼠视网膜的 VEGF（红色荧光）表达升高，且 AChE+/- +DM 组小鼠 VEGF 表达较 AChE+/+ +DM 组小鼠视网膜降

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