BDNF对高糖状态下视网膜神经元保护作用的实验研究

发布时间：2020-07-17 06:25

【摘要】：目的：建立高糖状态下视网膜神经元细胞模型,探讨外源性脑源性神经营养因子(BDNF)对高糖状态下视网膜神经元凋亡的保护效应,及可能的细胞内信号传递机制。同时建立糖尿病大鼠动物模型,探讨其视网膜组织病理学变化,以及与视网膜BDNF、酪氨酸激酶受体B (TrkB)、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达变化的关系,为BDNF潜在的临床应用价值提供理论依据。方法：本研究分两大部分进行。第一部分：1、以0、5.5、15、25、35mmol/L不同浓度葡萄糖分别作用于原代培养的Wistar大鼠视网膜神经元24、48、72h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及流式细胞仪分析检测神经元的存活率、凋亡率,确定葡萄糖最适干预浓度及时间,建立原代培养的大鼠视网膜神经元的高糖模型。2、予以75、100、125ng/mL不同浓度BDNF干预高糖状态下视网膜神经元96h后,采用MTT法及流式细胞仪分析检测神经元的存活率、凋亡率的变化,采用免疫细胞化学染色法观察BDNF受体TrkB的蛋白表达变化,确定BDNF最适干预浓度及时间。3、采用Western Blot法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测4个不同组(正常对照组,正常对照+BDNF组,高糖模型组,高糖+BDNF组)的TrkB、ERK的蛋白及mRNA, PTrkB、PERK蛋白的表达水平,分析BDNF对高糖状态下视网膜神经元中TrkB、ERK磷酸化的影响。第二部分：1、建立糖尿病大鼠动物模型,以正常大鼠为对照,分别于糖尿病成模后4、12、24W,采用苏木素/伊红(HE)染色观察大鼠后极部视网膜总厚度、视网膜神经节细胞(RGCs)计数以及视网膜组织形态学变化,透射电镜观察糖尿病24W大鼠视网膜各层组织细胞的超微结构变化。2、于糖尿病4、12、24W,采用免疫组织荧光化学法、免疫组织化学法、Western blot方法分别检测糖尿病组与正常对照组大鼠视网膜GFAP、TrkB及ERK、BDNF蛋白的表达,采用RT-PCR法检测两组大鼠视网膜TrkB、ERK、BDNFmRNA的表达。结果：第一部分：1、随葡萄糖浓度的增加及时间的延长,视网膜神经元的存活率下降、凋亡率增多,以35mmol/L葡萄糖干预72h的神经元存活率(OD值：0.0268±0.0116)下降、凋亡率(40.123±7.576%)增加最为显著(p0.01)。2、随着BDNF浓度的增加,高糖状态下视网膜神经元存活率增加、凋亡率下降,伴随着BDNF受体TrkB蛋白表达增高,以100ng/mlBDNF干预96h组凋亡率(3.458±1.531%)下降及TrkB蛋白表达增高最为显著(p0.05)。3、TrkB蛋白及mRNA在其它各组的表达均较正常对照组增加(p0.05),高糖+BDNF组比较高糖组TrkB表达亦增加(p0.05)；ERK蛋白及mRNA表达水平在各组之间无差异(p0.05); PERK, PTrkB蛋白在高糖组的表达与正常对照组比较无差异(p0.05),正常对照+BDNF组与高糖+BDNF组比较其它2组PERK、PTrkB表达显著增加(p0.05),高糖+BDNF组比较其它各组PERK、PTrkB表达显著增加(p0.05)。第二部分：1、糖尿病组在12、24W两个时间点与正常组相比较,后极部视网膜总厚度明显变薄(60.26±4.33.52.11±5.23μm), RGCs细胞数减少(67.57±2.59、54.93±2.02个),差异有统计学意义(p0.05)。糖尿病24W透射电镜观察显示：视网膜RGCs及神经胶质细胞有凋亡征象。2、免疫组织荧光化学法检测显示：随病程增加,GFAP蛋白在糖尿病大鼠视网膜的表达依次增强。免疫组织化学法及RT-PCR法检测显示：在病程4W时糖尿病大鼠视网膜的TrkB蛋白及mRNA表达比较正常组明显增加(p0.05),12W时表达比较正常组明显下降,24W时下降更明显(p0.01)；病程4、12、24W时糖尿病大鼠视网膜的ERK蛋白及1mRNA的表达均较正常组增加,差异有统计学意义(p0.05),但糖尿病各组之间比较无差异(p0.05)。Western blot法及RT-PCR法检测显示：随病程增加,糖尿病大鼠视网膜BDNF蛋白及mRNA表达依次下降,比较正常组差异有统计学意义(p0.05),且糖尿病各组之间也有统计学差异(p0.05)。结论：1、体外高糖水平可诱导视网膜神经元的凋亡。2、外源性BDNF对高糖诱导的视网膜神经元的凋亡具有保护作用,并能有效上调神经元细胞内TrkB蛋白及mRNA、PERK蛋白、PTrkB蛋白的表达,从而可能通过细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)信号转导途径调控视网膜神经元的凋亡。3、早期糖尿病大鼠动物模型存在神经视网膜的改变(RGCs及神经胶质细胞的凋亡),可能是研究早期糖尿病神经元病变有价值的模型。4、早期糖尿病大鼠神经视网膜病变可能与BDNF、TrkB蛋白及mRNA水平降低,GFAP蛋白、ERK蛋白及mRNA水平增高有关。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R774.1
【图文】：

葡萄糖,意义

糖在72h、25mmol/L葡萄糖在48h、72h，比较正常对照组有显著性差异(p<0.05)。且35mmol/L葡萄糖组在72h比较其它组凋亡率有非常显著性意义(p<0.001)。(表1一1一2，图1一1一8、9、10、11)

葡萄糖

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状态图,网膜,神经元,状态

自阵莽.材二图1一2一3不同浓度BDNF干预高糖状态下视网膜神经元96h后的凋亡率图注:(l)第2组较其它组凋亡率高(P<o01)。(2)第1组、4组、5组之间均无差异(p>0.05)。第l组与2、3组有差异(p<o刃l)。

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