FOXO3a调控鼻咽癌获得性放射抵抗的作用机制研究

发布时间：2020-07-27 19:02

【摘要】：第一部分FOXO3a对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响目的:检测沉默FOXO3a对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。方法:Western blotting实验和q RT-PCR实验检测多种鼻咽癌细胞系(CNE1,CNE2,HNE1,和CNE1-LMP1)中FOXO3a的基础表达量。Western blotting实验和Real-time polymerase chain reaction(q RT-PCR)检测了鼻咽癌细胞经过6Gy射线照射后不同时间点FOXO3a的表达情况。四种慢病毒Mock sh RNA、FOXO3a sh RNA1、FOXO3a sh RNA2和FOXO3a sh RNA3分别转染CNE2和HNE1,使用western blotting和q RT-PCR检测其转染效率。应用克隆形成实验检测沉默FOXO3a对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。western blotting实验和免疫荧光实验检测上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达与定位。划痕实验和Transwell实验检测沉默FOXO3a对鼻咽癌侵袭转移能力的影响。结果:各鼻咽癌细胞系中FOXO3a蛋白的基础表达量无明显差异。Western blotting实验和q RT-PCR证实经过6Gy射线照射后鼻咽癌细胞系中FOXO3a表达量明显减少,24h减少量达到最高峰。我们对CNE2和HNE1进行了慢病毒转染,western blotting实和q RT-PCR显示FOXO3a sh RNA3的转染效率最佳。于是我们选择转染了FOXO3a sh RNA3(CNE2-sh RNA3、HNE1-sh RNA3)和Mock sh RNA(CNE2-Mock、HNE1-Mock)的细胞来进行下一步实验。克隆形成实验发现不同剂量照射条件下的,CNE2-sh RNA3、HNE1-sh RNA3相较CNE2-Mock、HNE1-Mock克隆数明显增多,说明沉默FOXO3a可诱导鼻咽癌细胞发生放射抵抗。应用western blotting实验检测EMT相关蛋白表达情况,发现CNE2-sh RNA3、HNE1-sh RNA3相较CNE2-Mock、HNE1-Mock上皮相关蛋白E-cadherin的表达量明显减少,而间质相关蛋白vimentin、N-cadherin表达量明显增多。同时免疫荧光实验发现,CNE2-sh RNA3、HNE1-sh RNA3相较CNE2-Mock、HNE1-Mock定位于细胞膜上的蛋白E-cadherin荧光强度明显减弱,而定位于胞浆的vimentin荧光强度明显增强。以上实验证明沉默FOXO3a可诱导鼻咽癌细胞发生EMT。划痕实验和Transwell实验沉默FOXO3a可增强鼻咽癌细胞的侵袭转移能力。结论:沉默FOXO3a可诱导鼻咽癌细胞发生放射抵抗,其放射敏感性明显降低。沉默FOXO3a上皮相关蛋白E-cadherin的表达量明显减少,而间质相关蛋白vimentin、N-cadherin表达量明显增多,诱导鼻咽癌细胞发生EMT,可促进鼻咽癌细胞发生侵袭转移。第二部分沉默FOXO3a诱导鼻咽癌细胞放射抵抗的作用机制研究目的:研究FOXO3a调控鼻咽癌细胞放射抵抗的作用机制。方法:Western blotting实验和免疫荧光实验检测经过6Gy的射线照射后E-cadherin和β-catenin的表达情况。应用western blotting实验检测了Wnt/β-catenin通路相关基因的表达情况。应用流式细胞术检测了在射线照射下各组鼻咽癌细胞在48h和72h的凋亡情况。应用流式细胞术检测了在射线照射下各组鼻咽癌细胞在24h和48h的细胞周期的分布情况。将FOXO3a sh RNA和β-catenin sh RNA进行了共转染,并进行了克隆形成实验。应用western blotting实验检测了共转染FOXO3a sh RNA和β-catenin sh RNA后Wnt/β-catenin通路相关基因的表达情况。Western blotting实验和免疫荧光实验检测了共转染FOXO3a sh RNA和β-catenin sh RNA后EMT相关蛋白的表达情况。结果:Western blotting实验发现经过6Gy的射线照射后,总蛋白中E-cadherin的表达减少,同时核蛋白β-catenin的表达也明显增多。当FOXO3a被沉默后,其总蛋白E-cadherin表达减少更明显,细胞核内的β-catenin表达也明显升高。免疫荧光实验与western blotting实验结果相似。Western blotting实验发现沉默FOXO3a后,β-catenin的下游基因c-Myc和cyclin D1的含量升高,激活Wnt/β-catenin通路。流式细胞术显示沉默FOXO3a可抑制鼻咽癌细胞凋亡以及G2/M期阻滞。我们将FOXO3a sh RNA和β-catenin sh RNA进行了共转染,并进行了克隆形成实验,发现FOXO3a sh RNA相比Control sh RNA在6Gy照射下鼻咽癌细胞的克隆数明显增多,β-catenin sh RNA相比Control sh RNA在6Gy照射下鼻咽癌细胞的克隆数明显减少,FOXO3a sh RNA+β-catenin sh RNA相比FOXO3a sh RNA在6Gy照射下鼻咽癌细胞的克隆数减少。而沉默β-catenin可逆转沉默FOXO3a导致Wnt/β-catenin通路的激活,却对FOXO3a的表达无明显影响。沉默β-catenin也可逆转沉默FOXO3a导致的EMT。结论:沉默FOXO3a可促进β-catenin入核,使β-catenin的表达明显增多,进而上调其下游靶基因c-Myc和cyclin D1,激活Wnt/β-catenin通路,然后抑制鼻咽癌细胞的凋亡和G2/M期阻滞进而诱导鼻咽癌产生获得性放射抵抗的。沉默β-catenin可逆转沉默FOXO3a导致的β-catenin下游靶基因活化,但是对FOXO3a的表达无影响,说明沉默FOXO3a可单向调节Wnt/β-catenin通路进而诱导鼻咽癌细胞产生放射抵抗。沉默β-catenin也可逆转沉默FOXO3a导致的EMT,但是Wnt/β-catenin通路与EMT的具体调控机制仍旧需要进一步的研究。第三部分沉默FOXO3a诱导鼻咽癌细胞放射抵抗的体内研究目的:动物实验探讨FOXO3a对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。方法:建立裸鼠移植瘤模型,随机分组,分别为鼻咽癌细胞FOXO3a沉默组、空载组、鼻咽癌细胞FOXO3a沉默放疗组与空载放疗组。照射组给予8Gy射线照射,记录移植瘤出瘤时间,肿瘤体积,28天后处死裸鼠,取移植瘤拍照称重。免疫组化和western blotting实验检测了相关蛋白的表达情况。结果:4组裸鼠全部成瘤,CNE2-sh RNA3组和CNE2-sh RNA3 IR组成瘤时间平均为4天,CNE2-Mock组和CNE2-Mock IR组成瘤时间平均为6天。当肿瘤长到50mm3时,给予放疗组裸鼠局部10Gy射线照射.照射组较非照射组移植瘤的体积明显缩小,生长速度减缓。而沉默FOXO3a可使移植瘤生长迅速,体积较对照组明显增大。28天后处死裸鼠,取移植瘤拍照称重。照射组较非照射组移植瘤的重量明显减轻,沉默FOXO3a可使移植瘤重量较对照组明显增加。免疫组化实验发现CNE2-sh RNA3组对比CNE2-Mock组,FOXO3a的表达明显减少,E-cadherin的表达缺失,N-cadherin和vimentin的表达增多,说明沉默FOXO3a可在体内水平诱导EMT.同时CNE2-sh RNA3组对比CNE2-Mock组,β-catenin以及其下游的c-Myc、cyclin D1表达增多,GSk-3β表达减少,说明沉默FOXO3a可在体内水平激活Wnt/β-catenin通路。western blotting实验与免疫组化结果一致。沉默FOXO3a组相比对照组ki-67的表达明显增加,同时可抑制凋亡的发生。沉默FOXO3a后,移植瘤生长速度增快,可在体内水平诱导EMT和激活Wnt/β-catenin通路,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,使移植瘤出现放射抵抗。结论:沉默FOXO3a可在动物水平诱导鼻咽癌放射抵抗。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.63
【图文】：

1.1 鼻咽癌细胞系中 FOXO3a 的表达情况（A、Western blotting 实验检测各鼻咽癌细胞系XO3a 的蛋白表达。B、根据 FOXO3a 蛋白的灰度值绘制的柱状图。C、 qRT-PCR 实验检测癌细胞系中 FOXO3a mRNA 的基础表达量。*代表 P<0.05，**代表 P<0.01，* **代表 P<0.00. 检测射线对 FOXO3a 的表达的影响我们检测了鼻咽癌细胞系经过 6Gy 射线照射后不同时间点 FOXO3a 的表达情况estern blotting 实验证实各经过 6Gy 射线照射后鼻咽癌细胞系中 FOXO3a 蛋白的表达明显减少，24h 减少量达到最高峰，差异具有统计学意义（图 1.2A、B）。qRT-PC验证实各经过6Gy射线照射后鼻咽癌细胞系中FOXO3a mRNA的表达量明显减少4h 减少量达到最高峰，差异具有统计学意义（图 1.2 C）。证实射线照射与鼻咽癌细系中 FOXO3a 的表达量具有密切关系。

1.2 射线对 FOXO3a 的表达的影响（A、Western blotting 实验检测各经过 6Gy 射线照射后鼻咽胞系中 FOXO3a 蛋白的表达量。 B、根据 FOXO3a 蛋白的灰度值绘制的柱状图。C、qRT-PCR检测经过 6Gy 射线照射后鼻咽癌细胞系中 FOXO3a mRNA 的表达量。*代表 P<0.05， **代P<0.01，* **代表 P<0.001 ）检测沉默 FOXO3a 的转染效率为了进行下一步研究，我们对CNE2和HNE1进行了慢病毒转染。用四种慢病毒ck shRNA、FOXO3a shRNA1、FOXO3a shRNA2 和 FOXO3a shRNA3分别转染E2和HNE1, 使用western blotting和qRT-PCR检测其转染效率。Western blotting实验示，转染了FOXO3a shRNA的鼻咽癌细胞相对转染了Mock shRNA的鼻咽癌细胞可显抑制FOXO3a的蛋白表达，其中shRNA3的转染效率最佳（图1.3A、B）。qRT-PCR示转染了FOXO3a shRNA的鼻咽癌细胞相对转染了Mock shRNA的鼻咽癌细胞可明抑制FOXO3a的mRNA表达，抑制效率都>70%, 其中shRNA3的转染效率最佳（图1.3。于是我们选择转染了FOXO3a shRNA3（CNE2-shRNA3、 HNE1-shRNA3） 和

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文33图1.3 检测沉默FOXO3a的转染效率（A、western blotting实验检测转染效率。B、根据FOXO3a蛋白的灰度值绘制的柱状图。C、qRT-PCR实验检测转染效率。*代表P<0.05， **代表P<0.01，* **代表P<0.001）4. 沉默 FOXO3a 对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响我们应用克隆形成实验检测沉默FOXO3a对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。我们发现在不同剂量照射条件下的，CNE2-shRNA3、 HNE1-shRNA3相较CNE2-Mock、HNE1-Mock克隆数明显增多（图1.4 A）。 同时我们应用GraphPad Prism5.0 软件应用单机多靶模型绘制其拟合曲线，比较两组细胞放射敏感性差异以及相应放射生物学参数（图1.4 C）。CNE2-shRNA3、 HNE1-shRNA存活分数（SF2）、平均致死剂量（D0）和准域剂量（Dq）等放射生物学参数均显著高于CNE2-Mock、HNE1-Mock（见表1），（P<0.05），差异具有统计学意义。此部分实验说明沉默FOXO3a可诱导鼻咽癌细胞发生放射抵抗，其放射敏感性明显降低。ABC

【参考文献】

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本文编号：2772241