烟曲霉菌角膜感染介导TSLP活化DCs诱导Th2型炎症反应的实验研究

发布时间：2020-07-28 12:57

【摘要】：研究背景真菌性角膜炎(fungal keratitis,FK)是一种多发于热带及亚热带地区的感染性角膜病变,发病率极高,且有极高的致盲率。尤其是在发展中国家,FK为最常见的致盲性眼病之一,其发病率在各种严重感染性角膜病变中甚至可以居于首位。FK的病因多种多样,在发达国家,该病最常见的诱因为佩戴角膜接触镜;而在发展中国家,该病的主要诱因则是角膜外伤,尤其是植物性角膜外伤。在世界范围内,FK的致病真菌有七十余种,其中最常见的是镰刀菌属真菌和曲霉菌属真菌。临床数据表明,与其它真菌引起的角膜炎相比,曲霉菌性角膜炎具有诊断率低、药物治疗效果差、手术治疗需求率高、预后不良和复发率高等特点,已成为目前临床上最为棘手的FK之一。因此,本研究选用烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus,A.fumigatus)构建FK的动物模型并进行相关研究,这具有重要的理论价值和临床意义。FK病情进展迅速且预后相对不良,因此必须进行及时的诊断和有效的治疗,否则就有可能出现前房积脓、角膜穿孔、恶性青光眼或真菌性眼内炎等症状,甚至导致失明乃至眼球摘除的后果。目前的相关研究已经表明,在FK的过程中,机体的免疫功能是抵抗真菌感染的重要因素。因此,想要研究FK,就需要深入探究疾病发生发展过程中角膜的免疫防御体系。角膜由外向内依次分五层结构,角膜上皮细胞(cornal epithelial cell,CEC)因为居于角膜的最表面,因而成为了角膜抵挡病原微生物入侵的第一重生物学防线。病原微生物侵犯角膜组织时,CEC可以通过其上的Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)和 NOD 样受体(NOD like receptors,NLRs)等重要的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别病原微生物表面的病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs),从而启动下游的免疫反应,发挥抵抗病原微生物入侵的作用。我们的前期研究已经表明,在A.fumigatus性角膜炎发生发展的过程中,CEC表面上的TLR2和TLR4受体可以接受A.fumigatus的刺激并对它们进行识别,激活核转录因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)并启动NF-κB下游的信号通路,释放白细胞介素(interleukin,IL)-6,IL-8,IL-10,IL-1β和TNF-α等细胞因子以及hBD2和LL37等抗菌肽,并通过与NOD1和NOD2的交互作用参与免疫反应。胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)由基质细胞系产生,为一种IL-7样细胞因子,研究表明TSLP主要由各类上皮细胞分泌表达,并在免疫反应中发挥重要作用。在病原微生物的刺激下,呼吸道和CEC可以上调NF-κB信号通路并促进TSLP的分泌。TSLP受体(Thymic stromal lymphopoietin receptor,TSLPR)是一种由 TSLPR 和 IL-7R 的 α-链构成的异二聚体,在树突状细胞(dendritic cells,DCs)、淋巴细胞以及单核细胞等细胞的表面均有表达。我们的前期研究发现,在A.fumigatus性角膜炎发生发展的过程中,TLR2下游的TLR2/MyD88/NFκB-p65信号通路促进了 CEC对TSLP的分泌,并增强了 TSLPR的表达,启动了 TSLP/TSLPR下游的STAT5信号通路,参与了CEC的抗真菌反应,增强固有免疫,发挥抵抗真菌感染的作用。这提示了我们,TSLP显然参与了角膜抵抗真菌感染的过程。研究表明,TSLP通过多种方式作用于DCs,参与获得性免疫反应。在角膜创伤的过程中,在TSLP等因子的作用下,DCs与CEC协作,共同参与了角膜组织的修复和维护。TSLP可以激活CD11 c+DCs,促进其合成Th2(T helper type 2,Th2)细胞趋化因子,如胸腺活化调节趋化因子(thymus and activation-regulated chemokine,TARC)、巨噬细胞源性趋化因子(macrophage-derived chemokine,MDC)和肺活化调节趋化因子(pulmonary and activation-regulated,PARC)等,从而进一步促进CD4+T细胞增殖,并诱导CD4+T细胞分化为可分泌IL-4,IL-5,IL-13和TNF-α等细胞因子的Th2细胞,诱导Th2型炎症反应。OX40配体(L)是TNF超家族的成员之一,它可以与活化的T细胞表面的抗受体OX40结合,促进T细胞增殖,诱导获得性免疫反应,并促进免疫球蛋白的分泌。TSLP可以刺激DCs表达OX40L,促进DCs与T细胞结合,进一步诱导初始T细胞分化为Th2细胞,诱导Th2型炎症反应。在过敏性结膜炎中,TLR4配体可以刺激CEC表面的TLR,促进CEC分泌TSLP,并通过下游的TSLP/TSLPR信号通路诱导CD11c+DCs成熟,成熟的CD11c+OX40L+DCs则进一步通过OX40L与CD4+T细胞表面的OX40结合,诱导CD4+T分化为可分泌IL-4,IL-5,IL-13等细胞因子的Th2细胞,诱导Th2型炎症反应。然而,目前关于TSLP和DCs参与获得性免疫的研究多见于过敏性疾病,在感染性疾病,尤其是FK中相关研究十分少见。我们的前期研究发现,A.fumigatus刺激CEC产生的TSLP可以促进CD4+T细胞增殖,并诱导CD4+T细胞分泌IL-4,IL-13等Th2型细胞因子,诱导Th2型炎症,引发获得性免疫。然而,目前我们尚不清楚,在FK的过程中,TSLP具体是通过何种途径刺激CD4+T细胞增殖、分化并诱导Th2型炎症反应。DCs是否参与了这一过程,如果参与了,DCs在此过程中究竟起到何种作用?回答这些问题将帮助我们更清楚地了解,机体在角膜真菌感染的过程中启动获得性免疫的机理。这将为角膜抵抗真菌感染提供新的理论基础,为防治角膜真菌感染提供新的思考方向。本研究的结果表明,在角膜A.fumigatus感染的过程中,TSLP促进DCs聚集、活化、成熟和迁移;成熟的DCs分泌Th2细胞趋化因子,促进促炎因子和Th2细胞因子的分泌,诱导Th2型炎症反应。这有助于我们深入了解FK过程中获得性免疫反应的机理,为防治FK提供了新的理论基础和思考方向,具有重要的理论意义和临床价值。第一部分烟曲霉菌角膜感染介导DCs诱导Th2型炎症反应的实验研究[目的]研究A.fumigatus角膜炎中,树突状细胞(dendritic cells,DCs)参与免疫反应并诱导Th2型炎症反应的过程。[方法]1.用针头在野生型C57BL/6(B6)小鼠的角膜中央划出三道长度为1mm的划痕,用A.fumigatus菌液感染小鼠,将封口膜修剪成适合的角膜接触镜,置于小鼠角膜表面,并缝合小鼠眼睑,24小时后取出接触镜。在感染后0.5d,1d,3d,5d和7d于裂隙灯下观察感染情况,并进行临床评分,PBS处理的小鼠作为阴性对照组,未经处理的小鼠作为空白对照组;2.PCR检测感染不同时期小鼠角膜DCs的表达,PCR和Western blot检测感染不同时期小鼠角膜CD11c+DCs的成熟情况,免疫荧光检测感染不同时期小鼠角膜DCs的聚集、迁移和成熟,以及成熟DCs的迁移;3.PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测感染不同时期小鼠角膜DCs分泌的Th2细胞趋化因子TARC和MDC的表达情况,PCR和ELISA检测感染不同时期小鼠角膜促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4,IL-5和IL-13的表达情况,并进行统计学分析。[结果]随着感染的进行,角膜溃疡逐渐加重,而后逐渐减轻并形成瘢痕愈合。在感染的过程中,DCs聚集、成熟,由基底膜向角膜上皮层迁移,同时由角膜缘向角膜中心迁移,并于感染早期分泌TARC和MDC,于感染中晚期诱导促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4,IL-5和IL-13的表达。[结论]在A.fumigatus角膜炎的过程中,角膜中的DCs聚集,逐渐成熟并迁移,表达OX40L激活CD4+T细胞,分泌TARC和MDC发挥Th2趋化作用,并于感染中晚期诱导促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4,IL-5和IL-13的表达,诱导Th2型炎症反应。第二部分烟曲霉菌角膜感染介导TSLP活化DCs诱导Th2型炎症反应的实验研究[目的]研究 A.fumigatus角膜炎中,TSLP对DCs参与的免疫反应及其诱导的Th2型炎症反应的影响。[方法]1.野生型C57BL/6(B6)小鼠结膜下注射TSLP小干扰RNA(TSLP siRNA),乱序小干扰RNA,人重组TSLP蛋白(rTSLP)和IgG预处理。用针头在小鼠的角膜中央划出三道长度为1mm的划痕,用A.fumigatus菌液感染小鼠,将封口膜修剪成适合的角膜接触镜,置于小鼠角膜表面,缝合小鼠眼睑,并于感染后1d拆除缝线,于裂隙灯下观察感染情况,并进行临床评分,普通感染的小鼠作为对照组;2.PCR和Western blot检测不同处理组中小鼠角膜成熟DCs的表达情况,免疫荧光检测不同处理组中小鼠角膜成熟DCs水平迁移和垂直迁移情况;3.PCR和ELISA检测不同处理组中小鼠角膜DCs分泌的Th2细胞趋化因子TARC和MDC的表达情况,PCR和ELISA检测不同处理组中小鼠角膜促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4,IL-5和IL-13的表达情况,PCR和ELISA检测不同处理组中小鼠角膜Th1细胞因子IFN-γ和Th17细胞因子IL-17的表达情况,并进行统计学分析。[结果]与普通感染组小鼠相比,TSLP siRNA组中TSLP的表达显著下降,rTSLP组中TSLP的表达显著增加。TSLP siRNA组中小鼠角膜炎症情况显著减轻,rTSLP组中小鼠角膜炎症情况显著加重。TSLP siRNA组中TSLPR和OX40L的表达显著下降,rTSLP组中TSLPR和OX40L的表达显著增加。TSLP siRNA组中,成熟DCs的数量减少,迁移速率减慢,在角膜缘、角膜中间区和角膜中央区的数量均减少;rTSLP组中,成熟DCs的数量增加,迁移速率加快,在角膜缘、角膜中间区和角膜中央区的数量均增加。TSLP siRNA组中TARC和MDC的表达显著下降,rTSLP组中TARC和MDC的表达显著增加。TSLP siRNA组中TNF-α,IL-4,IL-5和IL-13的表达显著下降,rTSLP组中TNF-α,IL-4,IL-5和IL-13的表达显著增加。TSLP的变化对IFN-γ和IL-17表达没有显著影响。[结论]在A.fumigatus角膜炎的过程中,TSLP促进角膜中的DCs聚集,促进DCs表达OX40L成熟并迁移,促进DCs分泌TARC和MDC发挥Th2趋化作用,并于感染中晚期诱导促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4,IL-5和IL-13的表达,诱导Th2型炎症反应。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R772.2
【图文】：

小鼠,临床表现,荧光素染色,裂隙灯显微镜

图１小鼠角膜感染后的临床表现。小鼠角膜接种NB／ｗｍｆｇａｔｏ菌丝悬逡逑液（１０８ｃｆｕ／ｍＬ）后的第０．５，邋１，３，邋５，邋７天，观察小鼠角膜的感染情形和病灶特点，逡逑以裂隙灯显微镜拍摄记录Ａ；对小鼠膜做荧光素染色检查，观察小鼠角膜逡逑

标志物,角膜,小鼠

逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋０．５ｄ邋１ｄ邋３ｄ邋５ｄ邋７ｄ逡逑图２逦感染刺激小鼠角膜ＤＣｓ标志物ＣＤｌｌｃ和成熟标志物ＯＸ４０Ｌ的逡逑表达。小鼠角膜接种■菌丝悬液（１０８ｃｆｕ／ｍＬ）后的第０．５，１，３，５，７逡逑天，ＲＴ－ＰＣＲ检测ＤＣｓ标志物ＣＤｌｌｃ邋ｍＲＮＡ的表达变化（Ａ），邋ＲＴ－ＰＣＲ检测ＤＣｓ逡逑成熟标志物ＯＸ４０Ｌ邋ｍＲＮＡ的表达变化（Ｂ），Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＤＣｓ成熟标志物逡逑ＯＸ４０Ｌ蛋白的表达变化（Ｃ）（结果＝平数土标准差，＊Ｐ＜０．０５，邋＊＊Ｐ＜０．０１，对照组逡逑为阴性对照组）。逡逑５６逡逑

角膜,小鼠,分布和,冰冻切片

３邋Ａ／ｗｍ如如感染刺激小鼠角膜ＤＣｓ的迁移。小鼠角膜接种NB加《办血ｓ■０８ｃｆＷｍＬ）后的第０．５，邋１，３，邋５，邋７天，冰冻切片免疫荧光检测ＤＣｓ标和ＤＣｓ成熟标志物ＯＸ４０Ｌ的表达、分布和迁移（Ａ），全组织包埋ＤＣｓ成熟标志物ＯＸ４０Ｌ的表达、分布和迁移（Ｂ）。逡逑

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