缝隙连接蛋白缺陷聋的神经细胞模型的建立及致聋机制研究
发布时间：2020-07-30 20:49
【摘要】：缝隙连接蛋白的缺陷能引起缝隙连接通道功能障碍,从而导致多种严重疾病。所有缝隙连接蛋白中,缝隙连接蛋白26(Connexin26,Cx26)最为著名,发病率也最高。在几乎所有人种中,都发现了 Cx26缺陷相关的非综合征性或综合征性耳聋。Cx26缺陷常常会严重影响耳蜗功能导致耳聋。Cx26由GJB2基因编码,东亚人最高发的缺陷类型是235delC,其携带率约为1%。目前Cx26缺陷的致聋机制还未完全阐明,动物和人的研究存在差异,如在小鼠模型的研究中,完全敲除Cx26表达会阻碍跨胎盘的葡萄糖摄取,导致胚胎死亡。而人Cx26缺陷一般不会引起人胚胎的致死性事件,原因是人体胎盘屏障的结构与小鼠有很大的不同,Cx26缺陷不会影响人胚胎跨胎盘的葡萄糖摄取。但在听觉发育中,Cx26功能的重要性显然强于在胎盘中,Cx26缺陷常常造成听觉发育的异常,最终导致耳聋。2006 年 Takahashi 和 Yamanaka 发现通过调控体细胞的 Oct4,Sox2,Klf4,c-myc 这 4个基因可以将体细胞转化为诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)。中国学者随后证明了该细胞的全能性。iPSC像胚胎干细胞等其他多能干细胞一样,经过生长因子和细胞传代条件的调节,可以分化成神经元和胶质细胞。iPSC分化出的神经元细胞带有特定病人的基因信息,即带有特定的基因突变或神经疾病。在这样的条件下,我们能通过研究人的iPSC来研究特定人体的活体神经组织。近年的研究发现了数个可作为iPSC来源的简易途径,包括皮肤成纤维细胞、外周血细胞、角质形成细胞。iPSC技术的发明为人体疾病模型的建立、疾病细胞的研究和治疗提供了广阔的前景。本论文开展了如下三个方面的研究:1.采用非整合Episomal质粒诱导方式,重编程Cx26缺陷耳聋患者的体细胞,建立疾病特异的iPSC细胞系的初步研究。结果显示:患者的耳后皮肤组织切块,并原代培养后,于第7天,人皮肤组织周围可以观察到大量类成纤维细胞增生。将成纤维细胞扩增后,以非整合Episomal质粒电转染,电转染第7天能明显观察到细胞的形态由原先的梭形慢慢变圆,电转染患者成纤维细胞2周后,可以观察到一些形态类似于hESC的单克隆群落。所有患者来源细胞的培养中都可以收集到碱性磷酸酶阳性的类hESC单克隆群落。PCR排除了载体自身基因oriP/EBNA1整合入这些克隆的可能。传代数次后,分别得到了所有3个患者特异的iPSC系,依序分别命名为iPSC-1、iPSC-2、iPSC-3。DNA测序确认了这3个细胞系中Cx26 GJB2 235delC突变。免疫荧光确认了这3个细胞系都表达人胚胎多能性干细胞核蛋白OCT4 and膜蛋白SSEA4,而未检测到小鼠多能性干细胞特异性膜蛋白SSEA-1的表达。RT-PCR显示内源性OCT4,SOX2,NANOG,DPPA3的表达和H9 hESC基本一致。核型分析显示这些细胞系有正常的46条染色体。所有这些数据显示这些Cx26缺陷的iPSC系来源于人皮肤成纤维细胞,同时拥有多能干细胞的特征。2.评价Cx26缺陷iPSC细胞系向各胚层分化的体内、体外研究。为了评价Cx26缺陷iPSC细胞系的体外分化能力,将iPSC-1、iPSC-2、iPSC-3继续培养7天后分化为拟胚体(embryoid bodies,EBs)。实时PCR显示EBs表达所有三个胚层的关键标记物,包括外胚层的microtubule-associated protein 2(MAP2),paired box 6(PAX6),中胚层的Msh homeobox1(MSX1)和内胚层的 SRY-box containing gene 17(SOX17)(Fig.S2B)。为了评价体内分化能力,将iPSC-1、iPSC-2、iPSC-3各1X106细胞分别注入严重联合免疫缺陷鼠(severe combined immune deficiency,SCID)。4周后,可以从皮下得到各个细胞系形成的畸胎瘤。HE(hematoxylin-eosin)染色后,光镜下可以见到三胚层组织,包括内胚层的腺体结构、中胚层的软骨和外胚层的上皮、神经纤维。这些结果显示这三个系具有多能干细胞的体内体外分化能力。3.Cx26缺陷iPSC细胞系向神经细胞分化、建立疾病细胞模型、及其基因表达差异的研究。去除饲养细胞和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)后,3个iPSC系很快分化为EB。7天后EB进一步分化出神经上皮(neuroepithelial,NE),12-18天可以发现典型的神经管状花结。NE中高度表达PAX6和N-CADHERIN,并且在神经管形成后进一步上调,同时多能性基因NANOG在分化为神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)后显著下调。在神经分化过程中,具有典型柱状上皮形态的神经上皮细胞逐渐出现,第10天,免疫荧光可以染出强阳性的神经外胚层转录因子PAX6和NESTIN。神经球培养数天,可观察到突触样结构形成,向神经元分化。第20天,可以观察到NEUN、class Ⅲ β-tubulin(TUBB3)染色弱阳性的神经前体细胞。第42天,可观察到一些形态类似星形胶质细胞、高表达GFAP的细胞团。同期在其他细胞中可以观察到典型的神经元突触样结构,TUBB3染色强阳性。所有Cx26缺陷iPSC来源的神经细胞,和作为对照的hESC来源神经细胞没有观察到形态上的区别。以上结果显示,所有3个Cx26缺陷iPSC能够和hESC一样在体外分化为相似的神经前体细胞和神经元细胞,形态、内源性、外源性基因表达都非常一致。iPSC和hESC来源的神经元细胞中,Q-PCR检测缝隙连接蛋白基因GJB1(Cx32)、GJB2(Cx26)、GJD2(Cx36)表达水平,结果显示,所有iPSC来源神经元细胞与hESC来源神经元细胞比较,Cx26(GJB2)变化不显著,Cx32(GJB1)表达明显上调,Cx36(GJD2)表达略微上调。结论:能够成功通过非整合Episomal载体转染建立Cx26缺陷聋的iPSC细胞系,Cx26缺陷不影响细胞系的神经分化,在Cx26缺陷聋的神经细胞模型中,Cx32可能发挥代偿作用。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R764.43
【图文】：
２．４实验结果逡逑２．４．１人皮肤原代成纤维细胞的获得逡逑人皮肤原代培养一周后，可观察到大量长条梭形细胞增生，（图２－１）。逡逑图２－１培养一周时原代人成纤}赴义希疲椋纾玻卞澹裕瑁邋澹悖澹欤戾澹恚铮颍穑瑁铮欤铮纾澹铮驽澹穑颍椋恚椋簦椋觯邋澹悖酰欤簦酰颍邋澹簦镥澹簦瑁邋澹瑁酰恚幔铄澹妫椋猓颍铮猓欤幔螅翦澹悖澹欤欤箦澹铮睿邋澹鳎澹澹脲义希玻村义
本文编号：2776064
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R764.43
【图文】：
２．４实验结果逡逑２．４．１人皮肤原代成纤维细胞的获得逡逑人皮肤原代培养一周后，可观察到大量长条梭形细胞增生，（图２－１）。逡逑图２－１培养一周时原代人成纤}赴义希疲椋纾玻卞澹裕瑁邋澹悖澹欤戾澹恚铮颍穑瑁铮欤铮纾澹铮驽澹穑颍椋恚椋簦椋觯邋澹悖酰欤簦酰颍邋澹簦镥澹簦瑁邋澹瑁酰恚幔铄澹妫椋猓颍铮猓欤幔螅翦澹悖澹欤欤箦澹铮睿邋澹鳎澹澹脲义希玻村义
本文编号：2776064
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