低能量半导体激光促进血管内皮细胞增殖、迁移和管样结构形成的机制研究

发布时间：2020-08-03 09:49

【摘要】：目的探讨低能量半导体激光(Low-level semiconductor laser or Low-level laser therapy,LLLT)对体外血管内皮细胞的增殖、迁移和管样结构形成的影响及其相关的分子机制,从细胞水平和分子水平上为阐明低能量激光疗法促进义眼座血管化并防治义眼座暴露的作用机制提供实验依据,也为临床上治疗血管生成依赖性疾病提供新的思路。方法1.确定最佳的促体外细胞增殖的LLLT的照射方式:体外培养人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC细胞,在不同光照参数和照射方式的LLLT处理HUVEC,以CCK8法检测HUVEC细胞活性,确定低能量激光疗法发挥促进体外细胞增殖作用最佳的照射参数和照射方式,其中激光参数的变量包括:单次照射剂量/能量密度(0.1-20.0J/cm~2)和照射功率密度(2.07、5.25、9.92、20.99和31.35mw/cm~2);照射方式变量包括:照射间隔时间(48h、24h、12h、8h和6h)照射累计次数不同(照射间隔时间为12小时,累计照射次数分别为2、4和6次;间隔时间24小时,累计照射6次)。每项实验均设立不给予激光照射处理的对照组,其他处理同照射组。2.LLLT采用单次照射剂量(分别为1.0、2.0、4.0J/cm~2),照射间隔时间为12小时,累计照射6次的照射方式对HUVEC进行处理,并与无LLLT处理的对照组进行比较。(1)以CCK8法和EdU细胞增殖法检测LLLT对HUVEC增殖活力的影响;(2)划痕实验检测LLLT对HUVEC迁移的影响;(3)内皮细胞管腔形成实验检测对HUVEC管样结构形成能力的影响;(4)Western blot法检测HUVEC内PI3K/Akt通路中主要信号分子PI3K、Akt蛋白磷酸化的表达水平的变化,细胞内eNOS、HIF-1α和VEGFA蛋白表达水平;(5)ELISA法检测细胞培养上清液中VEGFA的含量变化情况;(6)用LY294002(2μM)预处理1h预处理并给与LLLT处理后检测HUVEC增殖、迁移和管样结构形成以及细胞内eNOS、HIF-1α和VEGFA的表达水平变化情况。结果1.最佳照射方式的确定:(1)促HUVEC增殖最佳剂量为4.0 J/cm~2,单次照射不同剂量的LLLT对HUVEC增殖的影响结果显示,单次照射需达到1.0 J/cm~2的激光剂量才能发挥促细胞增殖效应,在一定范围内加大单次照射剂量(1.0-4.0J/cm~2),可使LLLT促细胞增殖作用提高,继续加大单次照射剂量,LLLT促细胞增殖作用减弱,甚至会抑制细胞的增殖(20.0 J/cm~2);(2)不同功率密度对LLLT诱导细胞增殖结果显示,2.07-31.35mW/cm~2功率密度范围内的LLLT,均可促进细胞增殖,且在单次照射剂量相同条件下,增加激光照射的功率密度,可提高LLLT的促细胞增殖作用;(3)最佳照射间隔时间为12h,在单次照射剂量相同、功率密度相同条件下的LLLT,改变照射间隔时间当间隔时间为24h、12h和8h的LLLT可促进HUVEC的增殖,其中间隔时间为12h的LLLT促细胞增殖效果最佳,且间隔时间过长(48h)促细胞增殖效果不明显,间隔时间过短(6h)甚至会抑制细胞增殖,引起细胞凋亡。(4)最佳累计照射次数为6次,在单次照射剂量、功率密度恒定和照射间隔时间相同条件下,以累计照射次数为6次的照射方式促进细胞增殖效果均优于其他组,且累计照射次数相同条件下,照射间隔时间为12h的LLLT较间隔时间为24h相比,促细胞增殖作用明显提高。根据以上结果分析确定LLLT发挥促进体外细胞增殖作用最佳的照射方式为:单次照射剂量4.0J/cm~2,照射间隔时间为12h,累计照射6次。2.LLLT对HUVEC的增殖、迁移和管样结构形成的影响:(1)CCK8实验和EdU细胞增殖实验结果显示,LLLT处理后细胞活力显著增加,且LLLT促细胞增殖作用具有剂量依赖性;(2)划痕实验结果显示,LLLT处理后细胞迁移能力显著提高,LLLT促细胞迁移作用具有剂量依赖性,且随着激光照射次数的增加,LLLT促细胞迁移作用增强。(3)内皮细胞管腔形成实验结果示,单次照射剂量为2.0和4.0 J/cm~2的LLLT处理后较对照组比细胞管样结构形成能力显著提高,并具有剂量依赖性。3.Western Blot和EILSA结果显示:(1)使用LLLT处理后各组PI3K、Akt蛋白磷酸水平升高,eNOS、HIF-1α和VEGFA的表达水平升高,且蛋白磷酸化水平和蛋白的表达水平的变化与激光单次照射剂量存在依赖性;(2)LY294002预处理1h预处理给与LLLT处理后的HUVEC,与照射组相比较,LLLT促进细胞增殖和细胞迁移作用减弱,但对HUVEC管样结构的形成无明显影响;LY294002预处理1h预处理后可减弱LLLT诱导下细胞内eNOS、HIF-1α和VEGFA蛋白的表达水平的上调以及促进VEGFA的分泌。结论1.LLLT通过PI3K信号通路依赖性方式上调了细胞内HIF-1α、eNOS和VEGFA的表达水平和促进血管内皮细胞增殖、迁移。2.LLLT促血管内皮细胞管样结构形成作用可能是通过激活细胞内其他信号通路发挥作用。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R779.64
【图文】：

照射剂量,影响分析,低能量激光

第 3 章结果1 低能量激光最佳照射方式.1 单次照射不同剂量对 HUVEC 增殖的影响在本实验中检测了单次照射剂量不同条件下 LLLT 对 HUVEC 增殖的影验结果显示：低能量激光疗法对内皮细胞有促增殖的作用，且其作用具有依赖性，在单次照射剂量过低的低能量激光疗法对细胞增殖无影响（0.1J 0.5J/cm2）,与对照组相比，差异无统计学意义（p＞0.05），而过高的照则会产生抑制细胞增殖的作用（20J/cm2），与对照组相比，差异有统计学p＜0.01）；在一定照射剂量范围内（1.0-4.0J/cm2），低能量激光疗法促 HU殖的作用与照射剂量呈正相关，即照射剂量越大，促增殖效果越明显。计分析，单次照射剂量为 4.0J/cm2的 LLLT 促细胞增殖效果最佳（图 3-1

影响分析,激光照射,间隔时间

第 3 章结果不同的照射间隔时间对 HUVEC 增殖的影响实验中检测不同照射间隔时间的 LLLT 对 HUVEC 增殖的影响，：因照射间隔时间不同，LLLT 促 HUVEC 细胞增殖的效果不同，，照射间隔时间为 24h、12h 和 8h 的 LLLT 可促进 HUVEC 的增计学意义（均 p＜0.05），照射间隔时间为 6h 的照射组抑制了 HU与对照组相比，差异有统计学意义（p＜0.05）；可有效促进 HU射组之间两两对比，经过统计分析照射间隔时间为 12 小时的 LC 增殖的作用最佳（图 3-2）。

柱状图,影响分析,激光功率密度,标组

3 CCK8 法检测不同的激光功率密度对 HUVEC 增殖影响分析结果。以均值±标组吸光度值的柱状图，（*p＜0.05.vs control）。同时，我们还对后续实验中所用的不同功率密度条件下，观察单次照 1.0、2.0 和 4.0 J/cm2的 LLLT 对 HUVEC 增殖的影响。实验结果显示：率密度相同条件下，提高单次照射剂量可提高 LLLT 促细胞增殖作用

【相似文献】