微管保护剂埃博霉素D对外伤性视神经损伤保护机制研究

发布时间：2020-08-05 21:09

【摘要】：[目的]TON是目前外伤性损伤中导致视力下降的主要原因,主要表现为神经组织水肿和微循环障碍。然而目前临床上对TON治疗没有一种统一的诊断及处理标准,如果治疗不及时严重者可致盲。TON轴突改变主要是微管微丝的崩解致使神经元进一步凋亡的过程。近年来大量文献报道微管相关蛋白——Tau蛋白,具有稳定及促微管聚合功能,该功能主要通过Tau磷酸化水平进行调节。Tau磷酸化一直被认为是AD、PD等神经退行性疾病的发病机制之一。有文献显示在Tau转基因小鼠中运用微管稳定剂埃博霉素可改善小鼠认知障碍、减少Tau病变。本课题首次将微管稳定剂埃博霉素运用于视神经夹持镊建立大鼠外伤性视神经病变模型中,研究TON后给予埃博霉素是否会出现视神经轴突及视网膜神经节细胞的修复再生,观察是否会出现视神经传导通路改善情况及Tau蛋白磷酸化改变情况。为TON的治疗及其他神经退行性疾病研究提供参考依据。[方法]采用50 g力度的视神经夹持镊建立大鼠视神经夹持损伤模型;将94只成年SPF级雌性SD大鼠随机分成埃博霉素治疗组(n=12)和溶剂对照组(n=12)。实验组给予埃博霉素腹腔注射1mg/kg,对照组给予同样体积的溶剂DMSO腹腔注射,同时行左眼视神经夹持损伤模型,右眼分离视神经,不行夹持。损伤后时间点分别在3D、7 D进行取材,每个时间点共6只大鼠。Western blot实验(n=3)观察分别给予埃博霉素和DMSO后视网膜及视神经在相应时间点的Tau蛋白表达水平及磷酸化变化情况;采用免疫荧光组织化学染色法(n=3)观察大鼠视神经损伤后给药及不给药不同时间点视神经轴突再生变化情况,及全视网膜神经节细胞(RGCs)的变化情况;并采用免疫荧染色方法(n=3)观察视神经微管变化及轴突再生共表达情况;同时埃博霉素治疗组(n=10)建立大鼠FVEP检测模型,分别在1D,28D时间点检测FVEP变化。随机分为TON后基础Tau蛋白磷酸化变化数据组(n=30)及TON后不同时间点FVEP改变数据组(n=30),分别在1D,3D,7D,14D,28D进行取材及FVEP数据采集,每个时间点6只,Western blot实验(n=6)观察损伤后的视网膜及视神经在相应时间点的Tau蛋白表达水平及磷酸化变化情况及不同时间点视神经传导通路变化情况。[结果]Western blot实验显示:TON后基础Tau磷酸化改变情况:TON后视神经Tau蛋白含量持续降低后恢复正常;TON后视神经Tau蛋白396/404磷酸化含量变化情况与Tau蛋白含量的变化情况一致;TON后14D时视神经Tau蛋白396/404位点磷酸化程度增加;TON后视网膜Tau蛋白含量迅速降低后增量表达;TON后视网膜Tau蛋白404磷酸化含量变化情况与Tau蛋白含量的变化情况相同而396位点则不同;TON后视网膜Tau蛋白396/404位点的作用时空不同。TON后埃博霉素D治疗Tau磷酸化改变情况:埃博霉素D治疗TON后视神经Tau蛋白含量持续降低;埃博霉素治疗TON后视神经Tau磷酸化水平增高;埃博霉素D治疗TON后视网膜Tau蛋白含量增高;埃博霉素D治疗TON后视网膜Tau-396磷酸化水持续增高,404磷酸化水平短暂增高后降低。采用免疫荧光组织化学染色法显示:3D给药组与溶剂对照组RGC改变比例差异有统计学意义(P0.05),且7D给药组与对溶剂照组RGC改变比例差异有统计学意义(P0.05)。TON溶剂对照组:TON损伤眼视神经中夹持点附近出现细胞核增多现象,且增多的细胞核向夹持部位远端蔓延;神经特异性的β-3 Tublin提示远离夹持部位同样出现空洞,且残存的β-3Tublin形态不规则,呈现出扭结状;同时难以检测到GAP43的表达;视网膜中GAP43表达降低,难以与β-3 Tublin共定位;TON治疗组:TON治疗眼视神经中夹持点附虽然同样出现细胞核增多现象,但仅局限于夹持部位,未向夹持部位的远端蔓延,神经特异性的β-3 Tublin染色夹持部位远端未发现空洞,存留的β-3 Tublin形态完整为与正常眼情况类似的条索状;治疗组中,在夹持损伤部位检测到大量的GAP43表达。治视网膜GAP43和β-3 Tublin表达量均增加,共表达加强。视神经轴突再生表达的GAP43表达模式存在两种,即核定位表达及随β-3 Tublin成纤维状;与核定位的GAP43为星型胶质细胞表达,通过将视神经星型胶质细胞与GAP43共染发现,GAP43能够与GFAP标记的星型胶质细胞共表达,证实GAP43的部分来源为星型胶质细胞罗兰电生理显示:假手术眼出现了典型的FEVP波形,表明仅暴露视神经并不会影响FVEP的各项指标;手术眼FVEP出现明显的波形改变,具体表现为N1波出现延迟,P1-N1波振幅缩减;手术眼相较于假手术眼其FVEPN1峰在各个测量时间点上均存在明显的延迟(P0.01),平均延迟时间为14.34 ms;手术眼相较于假手术眼其FVEP P1-N1的振幅差在各个测量时间点上均显著变小(P0.01),平均增幅缩减-40.30μs;TON损伤发展过程中,手术眼相较于假手术眼的FVEP P1-N1振幅缩减情况在不同时间点上没有明显的改善或加重现象,而N1延迟程度在3D-7D时期内发生了轻微的自然缓解现象(P0.05)。TON后给予埃博霉素D治疗后FVEP出现了视神经传导通路改善情况。[结论]1.大鼠TON造模后可致由FVEP检测的视觉电信号传导减缓且电信号传导质量降低,视神经夹持后可导致视觉电信号传导通路发生障碍。2.大鼠TON建模后可致视神经中游离Tau蛋白含量降低且磷酸化水平增高;而视网膜中的RGC胞体在损伤后发生了持续的游离Tau消耗的过程且胞体内Tau未检测到发生广泛的磷酸化现象。3.TON后给予埃博霉素D,视神经传导通路改善;4.TON后给予埃博霉素D抑制了视网膜神经节细胞的凋亡;TON后给予埃博霉素D,视神经及视网膜均出现轴突再生现象;视神经中指示再生的GAP43存在于细胞核附近且能够与GFAP共定位,提供轴突生长的GAP43蛋白可能来源于星型胶质细胞5.TON后给予微管稳定剂埃博霉素D,视神经游离Tau蛋白水平降低,视网膜中游离Tau蛋白水平增高;而两部位的Tau-396/404位点的磷酸化水平均不同程度的得到增强。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R779.1
【图文】：

图２邋Ｔａｕ蛋白磷酸化位点逡逑最早Ｔａｕ蛋白与疾病的相关性是来源于阿尔兹海默症（ＡＤ）、帕金森（ＰＤ）等逡逑神经退行性疾病研究中，显示增高的Ｔａｕ磷酸化水平是直接的致病因素。Ｔａｕ蛋逡逑白调控微管稳定性主要通过磷酸化和异构化作用。当Ｔａｕ蛋白被高度磷酸化后会逡逑诱导形成Ｔａｕ寡聚体，进而损坏正常的微管网状结构［２４］。磷酸化通过改变Ｔａｕ逡逑蛋白特性，使正常的游离Ｔａｕ变成神经纤维缠结－Ｔａｕ存在子损伤后的神经元内，逡逑结果导致Ｔａｕ结合和稳定微管的能力下降，影响正常微管组装过程，最终影响神逡逑经元的细胞生物学功能。逡逑１４逡逑

等细胞关键生物学过程中的功能基础。微管相关蛋白一￣Ｔａｕ蛋白，是影响微管逡逑稳定性的重要分子。逡逑正常情况下，Ｔａｕ蛋白功能主要是被Ｔａｕ选择性的磷酸化所调节的（如图２逡逑所示）。Ｔａｕ蛋白结合微管蛋白并作为微管早期装配的核心，促进微管蛋白在此逡逑核心上延伸聚集形成微管。Ｔａｕ蛋白通过其Ｃ端的重复区域和微管结合，刺激微逡逑管的组装，从而促进微管成核、生长和成束，并显著减少微管的动态不稳定性逡逑［２５－２７］。有研宄表明，Ｔａｕ蛋白和轴浆运输密切相关，Ｓｔａｍｅｒ等发现［２５］，过表达逡逑Ｔａｕ蛋白会抑制轴浆运输，抑制线粒体、突出囊泡等细胞器在突触中的分布。研逡逑究显示Ｔａｕ蛋白的过量表达可导致微管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ，ＭＴｓ）的局部裂解及轴突交逡逑通阻滞，这将打乱ＭＴｓ的平行队列，ＭＴｓ碎片失去它们的原本方向，便自由地逡逑朝各个方向散开而形成ＭＴｓ漩涡［２８］（如图１）。这种不规整的微管网路可能是逡逑抑制神经元轴浆运输的原因之一。在原代神经元中对线粒体实时成像结果显示

等细胞关键生物学过程中的功能基础。微管相关蛋白一￣Ｔａｕ蛋白，是影响微管逡逑稳定性的重要分子。逡逑正常情况下，Ｔａｕ蛋白功能主要是被Ｔａｕ选择性的磷酸化所调节的（如图２逡逑所示）。Ｔａｕ蛋白结合微管蛋白并作为微管早期装配的核心，促进微管蛋白在此逡逑核心上延伸聚集形成微管。Ｔａｕ蛋白通过其Ｃ端的重复区域和微管结合，刺激微逡逑管的组装，从而促进微管成核、生长和成束，并显著减少微管的动态不稳定性逡逑［２５－２７］。有研宄表明，Ｔａｕ蛋白和轴浆运输密切相关，Ｓｔａｍｅｒ等发现［２５］，过表达逡逑Ｔａｕ蛋白会抑制轴浆运输，抑制线粒体、突出囊泡等细胞器在突触中的分布。研逡逑究显示Ｔａｕ蛋白的过量表达可导致微管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ，ＭＴｓ）的局部裂解及轴突交逡逑通阻滞，这将打乱ＭＴｓ的平行队列，ＭＴｓ碎片失去它们的原本方向，便自由地逡逑朝各个方向散开而形成ＭＴｓ漩涡［２８］（如图１）。这种不规整的微管网路可能是逡逑抑制神经元轴浆运输的原因之一。在原代神经元中对线粒体实时成像结果显示

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 吕立权;卢亦成;;髓鞘相关抑制分子和视神经再生[J];中华眼科杂志;2006年09期

2 李灿,王一;睫状神经营养因子对大鼠视神经不全损伤后轴浆运输的影响[J];第三军医大学学报;2004年05期

相关博士学位论文 前1条

1 张立风;小鼠慢性应激模型海马中tau蛋白磷酸化及其对线粒体轴浆运输的影响[D];中国科学技术大学;2011年

本文编号：2781880