Toll样受体—髓样分化因子88介导的炎症反应在视神经创伤与修复中的作用

发布时间：2020-08-15 20:35

【摘要】：视神经在眼眶内活动程度受限，以致在头部受到外力冲击时极易造成直接和间接的原发性损伤，以及其后产生的包括血管痉挛或栓塞导致视神经的缺血、变性或坏死，以及免疫与炎性反应等继发性损害。髓样分化因子88（MyD88）是多种固有免疫受体在细胞内的衔接蛋白，其依赖途径参与脊髓损伤与修复，在脑损伤后的炎症反应中起关键作用。视神经同属中枢神经系统，因此我们认为MyD88可能是调控视神经创伤后炎症反应的靶点，对视神经损伤的修复发挥重要作用。本研究分以下四个部分：（1）成年SD大鼠视神经夹伤/离断模型的建立与改良；（2）阻断MyD88通路对成年大鼠视神经离断后视网膜神经节细胞（RGCs）存活的影响；（3）阻断MyD88通路对成年大鼠视神经夹伤后视神经干中TLR4、NF-κB表达的影响；（4）阻断MyD88通路对成年大鼠视神经夹伤后视神经干中GAP-43表达的影响。第一部分：成年大鼠视神经夹伤与离断模型的建立和改良成年大鼠视神经夹伤/离断模型已趋成熟，在相关领域基础研究中应用广泛。然而，既往建模手术方法繁琐，难度较大，手术耗时较长，加之目前常用的单一麻醉方法容易造成大鼠呼吸抑制而死亡。本文作者在建立视神经损伤动物模型时，在开创部位、操作方法和麻醉方法等方面进行了改良。结论：以戊巴比妥和陆眠宁联合麻醉取代单一戊巴比妥钠麻醉，并使用可产生恒定夹伤力的特制动脉瘤夹，能够缩短手术时间，并降低手术难度和实验动物的死亡率。第二部分：阻断MyD88通路对视神经离断后RGCs存活的影响方法：成年大鼠左侧视神经离断后随机分为三组：（1）MIP实验组：左眼玻璃体腔内注射MyD88抑制肽；（2）CP对照组：左眼玻璃体腔内注射对照肽；（3）PBS对照组：左眼玻璃体腔内注射PBS缓冲液。术后14d处死各组大鼠，视网膜取材，4%多聚甲醛后固定后视网膜全铺片，计数荧光金逆行标记的RGCs并计算出存活RGCs平均密度。结果：MIP实验组存活节细胞平均密度（1206±134/mm2）较CP对照组（908±112/mm2）和PBS对照组（879±123/mm2）显著增高（p0.01），而CP和PBS两对照组间无显著差异（p0.05）。结论：阻断MyD88通路对成年大鼠视神经损伤后的RGCs具有神经保护作用。第三部分：阻断MyD88通路对夹伤视神经干中TLR4和NF-kB表达的影响方法：成年大鼠左侧视神经夹伤后随机分为四组：（1）MIP实验组：左眼玻璃体腔内注射MyD88抑制肽；（2）CP对照组：左眼玻璃体腔内注射对照肽；（3）PBS对照组：左眼玻璃体腔内注射PBS缓冲液；（4）空白对照组：视神经夹伤后未予任何处理。于视神经损伤后1d、3d、7d或14d处死动物，视神经干取材行蛋白质免疫印记（Western Blot）实验。结果：（1）与空白对照组相比，MIP实验组、CP对照组和PBS对照组TLR4蛋白表达量在1d、3d、7d及14d所有时间点均显著增高（p＜0.01）；在术后1d时间点，MIP实验组、CP对照组和PBS对照组间TLR4蛋白表达量无统计学差异（p＞0.05）；当术后存活时间升至3d、7d及14d时，MIP实验组较CP对照组及PBS对照组TLR4蛋白表达量显著降低（p＜0.01），而CP对照组和PBS对照组间均无统计学差异（p＞0.05）。（2）与空白对照组相比，MIP实验组、CP对照组和PBS对照组NF-κB蛋白表达量在1d、3d、7d及14d所有时间点均显著增高（p＜0.01）；MIP组NF-κB表达量在各时间点较CP对照组和PBS对照组均有显著降低（p＜0.01），但CP对照组和PBS对照组在各时间点的NF-κB表达量并无明显差异（p＞0.05）。结论：早期阻断MyD88通路对视神经损伤后RGCs的保护作用，与TLR4和NF-κB蛋白表达的下调相关。第四部分：阻断MyD88通路对夹伤视神经干中GAP-43表达的影响第四部分采用夹伤模型的建造及处理方法，分为四组，即完全空白对照的Con组、以及经手术和术后玻璃体注射处理的MIP组、CP组及PBS组。待模型制造完成后于1d、3d、7d及14d不同时间点对大鼠处死进行视神经干的取材。视神经干组织直接存放于-70℃冰箱待进行Western-blot实验。结果：在视神经损伤后1d、3d、7d及14d所有时间点，MIP实验组、CP对照组和PBS对照组GAP-43蛋白表达量与空白对照组相比均显著增高（p＜0.01），MIP实验组较CP对照组和PBS对照组GAP-43蛋白表达量显著增高（p＜0.01），而CP对照组和PBS对照组间GAP-43蛋白表达量均无统计学差异（p＞0.05）。MIP实验组GAP-43蛋白表达量随术后存活时间的增加而逐渐增高，术后7d时达到最高值，但术后14d表达值明显下降。结论：早期阻断MyD88通路可提高RGC的轴突再生能力。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R779.1

【引证文献】