基于形态学方法研究间歇低氧对大鼠多脏器损伤及自噬的影响

发布时间：2020-08-31 10:02

　　目的:阻塞型睡眠呼吸暂停(OSA)患者常继发代谢综合征、非酒精性脂肪肝、认知功能障碍等多系统疾病,且OSA致多系统损伤的原因可能与其主要病理生理改变间歇低氧(IH)有关。尽管有大量研究证实了间歇低氧与多系统损伤之间的关系,但这些研究对于脏器损伤的探讨是局限于单一脏器的,缺乏对个体多脏器损伤的系统性观察及研究。此外,自噬作为细胞维持自身稳态的主要调节机制,在缺血/缺氧等多种条件下发挥着重要作用,与细胞损伤关系密切。间歇低氧是低氧的一种形式。已有研究发现间歇低氧可诱导心肌细胞损伤增加,且伴随着细胞损伤,心肌细胞自噬表达亦明显增多。我们前期体外研究也发现,间歇低氧处理后海马神经细胞凋亡增多的同时也伴随着自噬激活。然而,值得注意的是,自噬在不同的细胞中有着不同的形态学特征,也发挥着不同的生物学作用。基于此,我们推测在间歇低氧致多脏器损伤的过程中也有自噬的参与,但不同脏器自噬表现不同。本研究拟通过建立间歇低氧大鼠模型,使用HE染色、电镜、免疫组化等方法,观察间歇低氧暴露后大鼠海马、心肌、肾脏、肝脏和胰腺等多脏器的损伤变化,同时,探讨不同脏器间各组织细胞自噬的特征性改变,旨在为OSA致多脏器损害的发病机制提供一定的理论基础。方法:间歇低氧模型的建立:12只雄性SD大鼠(3-8周龄,体重280-340g)被随机分为正常对照组与间歇低氧组,每组6只。其中正常对照组给予常氧(21%O_2),间歇低氧组给予5-21%的氧浓度,每个循环周期120秒,每天间歇低氧8小时。在间歇低氧6周后处死大鼠,提取海马、心肌、肾脏、肝脏和胰腺组织,经过包埋、切片等步骤后,用HE染色观察大鼠各脏器的病理损伤情况,通过透射电镜观察各脏器超微结构改变及自噬的发生,通过免疫组化检测观察各脏器自噬标记蛋白轻链3(LC3)的改变。结果:1.海马组织:对照组脏器无明显病理损伤及超微结构改变。间歇低氧组海马神经细胞核深染,电镜下可观察到双层膜结构,自噬标记物LC3的表达增多。2.心肌组织:HE染色显示对照组心肌细胞排列较整齐,间歇低氧组心肌细胞肿胀、排列紊乱,心肌纤维断裂。电镜下可见对照组大鼠心肌富含线粒体,间歇低氧组可见线粒体肿胀,双层膜结构形成,免疫组化显示自噬标记物LC3的表达增多。3.肾脏组织:HE染色显示对照组大鼠肾小管结构基本正常,肾小球毛细血管红细胞减少,轻度缺血。间歇低氧组肾组织中肾小管损伤较肾小球损伤更明显,可见肾小管上皮细胞变性,管腔狭窄,少量炎性细胞浸润。电镜下可见线粒体嵴增宽,线粒体肿胀。自噬标记蛋白的棕黄色颗粒主要集中在肾小管上皮细胞。4.肝脏组织:HE染色显示对照组肝板排列较整齐,细胞形态基本正常。间歇低氧组肝细胞较对照组肿胀、稀疏。电镜下可见增多的双层膜结构及空泡。自噬标记物LC3的表达增多。5.胰腺组织:HE染色显示对照组胰腺细胞结构基本正常,间歇低氧组细胞出现肿胀,排列紊乱。电镜下可见双层膜结构增多,与其他组织不同的是其包裹物为内质网。自噬标记物LC3的表达增多。6.各个脏器病理损伤程度不同:如在海马组织细胞中间歇低氧后病理损伤及超微结构变化不明显,而肾组织中可见间歇低氧组有较明显的细胞变性及炎性浸润,且以肾小管损伤为主。7.自噬在本实验提取的5种脏器中均有发生,但不同脏器自噬特点不同。例如海马、心肌等线粒体丰富的脏器,以线粒体自噬为主。而分泌旺盛的器官如胰腺,以内质网自噬为主。结论:本研究证实间歇低氧可引起大鼠海马、心肌、肾脏、肝脏和胰腺等多个器官的病理损伤,但不同脏器损伤程度表现不同。同时,间歇低氧后,伴随着损伤的发生,海马、心肌、肾脏、肝脏和胰腺自噬表达也增加,而且在不同脏器,自噬特点不同。在海马、心肌、肾脏、肝脏等线粒体丰富的脏器,以线粒体自噬为主,胰腺富含内质网,以内质网自噬为主。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R766
【部分图文】：

自噬,受损情况,免疫组化,低氧暴露

察了间歇低氧暴露对大鼠海马神经细胞超微结构的影响马神经细胞未见明显异常，可见较清晰的线粒体结构，结构形成，同时伴随着肿胀线粒体增多，内质网扩张等（们通过免疫组化进一步观察了间歇低氧暴露对大鼠海马 LC3 表达的影响。结果显示，间歇低氧组 LC3 棕黄色颗图 2.1E-F）。

自噬,免疫组化,心肌组织,电镜

间歇低氧组可见双层膜结构包裹的线粒体样物质（图 2.2C-D）。接着，我们通过免疫组化进一步观察了间歇低氧暴露对大鼠心肌细胞自噬标记蛋白 LC3 表达的影响。结果显示，间歇低氧组LC3棕黄色颗粒较正常对照组增多（图2.2E-F）。

自噬,免疫组化,电镜,低氧

2.3 肾脏组织损伤及自噬表达（HE×400，电镜 C×15000400）织损伤及自噬表达先通过 HE 染色观察了间歇低氧暴露对大鼠肝脏组织细示，正常对照组肝细胞形态较完整，结构基本正常。间胞质稀疏，核染色较深（图 2.4A-B）。其次，我们通过电对大鼠肝脏细胞超微结构的影响。结果显示，正常对照较正常，无内质网扩张。间歇低氧组可见细胞器损伤以多（图 2.4C-D）。接着，我们通过免疫组化进一步观察了脏细胞自噬标记蛋白 LC3 表达的影响。间歇低氧组 LC3组增多（图 2.4E-F）。

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