链霉素损伤耳蜗毛细胞的机制研究
发布时间：2020-08-31 17:48
第一部分 PARP-1介导的AIF转位参与链霉素导致耳蜗毛细胞损伤的机制研究研究目的:氨基糖苷类药物导致的毛细胞损伤是感音神经性听力损失研究的重要内容。以链霉素为代表的耳毒性药物在临床上仍然有着重要的应用。目前药物性毛细胞损伤的确切机制尚未完全阐明,传统观点认为其是由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)介导的细胞凋亡过程,但是也有观点认为非Caspases依赖的程序性细胞死亡通路也在其中起着重要的作用。本研究希望通过建立耳蜗毛细胞链霉素损伤模型,探讨一种重要的线粒体来源的细胞死亡调控因子——凋亡诱导因子(AIF),在毛细胞死亡过程中的作用并明确其调控机制,完善链霉素相关听力损失的防治理论基础并寻求新的治疗靶点。研究方法:体外原代培养乳大鼠耳蜗基底膜毛细胞和连续培养HEI-OC1细胞,加入硫酸链霉素(以下简称链霉素)建立毛细胞体外损伤模型,加入链霉素和PARP-1抑制剂3-AB建立毛细胞保护模型。通过Myosin Ⅶla免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察毛细胞,确定链霉素处理24h后基底膜毛细胞的数目及形态并选择合适浓度的链霉素进行后续处理;MTT法检测HEI-OC1细胞链霉素处理后的相对存活率以确定后续实验链霉素浓度,检测3-AB(1 mM)对毛细胞损伤的保护作用;免疫荧光染色结合共聚焦显微镜观察毛细胞内AIF核转位和PARP-1的激活情况;利用线粒体分离技术和Western-blot分析AIF在细胞内线粒体和细胞质中的含量改变;qRT-PCR和Western-blot检测HEI-OC1细胞内PARP-1 mRNA和蛋白的表达情况。研究结果:与对照组相比,不同浓度链霉素(1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml)处理24h后基底膜均出现萎缩,Myosin Ⅶa免疫荧光显示毛细胞不同程度的减少、排列紊乱。链霉素浓度越高,毛细胞损伤越严重。相同链霉素处理浓度下,毛细胞损伤从顶回向底回逐渐加重,其中内毛细胞和外毛细胞损伤程度类似。MTT结果显示链霉素导致的HEI-OC1细胞损伤同样随浓度增加而加重。链霉素(2mg/ml)处理耳蜗基底膜后,残留毛细胞细胞核中既有萎缩表现,也有肿胀表现。对照组基底膜毛细胞免疫荧光染色显示AIF仅出现在细胞浆区域,细胞核区域无染色,而链霉素处理后,毛细胞AIF染色增强,并且细胞核区域出现了明显染色。HEI-OC1细胞中,免疫荧光显示链霉素(5mg/ml)处理后AIF散在出现在细胞核中,Western-blot显示链霉素处理后细胞线粒体内AIF表达降低,细胞质内表达量升高。免疫荧光显示对照组基底膜毛细胞和HEI-OC1细胞均未见明显PARP-1染色,链霉素处理后细胞核出现了 PARP-1强染色。qRT-PCR显示链霉素处理后HEI-OC1细胞PARP-1 mRNA表达明显升高,Western-blot显示PARP-1蛋白表达明显升高。加入3-AB后,MTT检测显示链霉素造成的HEI-OC1细胞损伤减轻,而且Western-blot结果也显示链霉素造成的AIF线粒体中蛋白表达降低而细胞质中升高的趋势消失。研究结论:链霉素可以导致耳蜗毛细胞浓度和位置依赖性的损伤;链霉素损伤毛细胞过程中AIF从线粒体转位到细胞核和细胞质;AIF的转位过程受PARP-1调控。第二部分内毛细胞带状突触在联合应用链霉素和速尿导致的大鼠听力损失中的改变研究目的:目前氨基糖苷类抗生素耳毒性的研究多集中在其如何损伤耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞等,还没有文章探讨听觉传导通路中第一个信号传递点——带状突触,在急性药物性耳聋中的改变。耳蜗中带状突触是一种特化的突触连接,位于毛细胞和螺旋神经节细胞之间,对声音信号快速、持续而准确的传递有着重要的作用。目前研究认为,带状突触可能是听觉通路中最脆弱的部分。我们希望通过速尿和链霉素联合应用构建大鼠急性听力损失模型,探讨药物作用下内毛细胞带状突触的改变。研究方法:大鼠同时分别腹腔注射速尿(200m/kg)和肌肉注射硫酸链霉素(200mg/kg)以构建大鼠急性听力损失模型。听性脑干反应(ABR)检测大鼠各频率的听阈;CtBP2、GluR23、Myosin Ⅶa以及Tuj-1免疫荧光染色分别标记突触前部分、突触后部分、毛细胞和螺旋神经节细胞并进行相应的统计分析。研究结果:ABR显示大鼠同时注射速尿和链霉素后1 d即出现全频的听力损失,且1月后仍不能恢复。与对照组相比,药物处理后大鼠基底膜毛细胞CtBP2染色显示带状突触数目明显减少,呈自顶回向底回逐渐加重的趋势,且其损失程度比内毛细胞减少程度更严重。药物处理后残留的部分突触出现肿胀、位置移动等异常表现,且与数目减少程度呈正相关。CtBP2和Glu R23标记的突触前后部分在药物处理10 d后明显分离。药物处理10 d后螺旋神经节细胞无明显改变,但是1月后其胞体和神经纤维明显减少,且以顶回和中回为甚。研究结论:速尿和链霉素联合应用可以引起大鼠不可逆的全频听力损失;速尿和链霉素引起的早期听力损失可能由带状突触损伤引起。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R764
【部分图文】：
图２．内毛细胞带状突触模式图逡逑考文献（Ｌｉｂｅｒｍａｎ邋Ｍ邋Ｃ．邋Ｎｏｉｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ａｎｄ邋ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ邋ｈｅａｒｉｓ邋ａｎｄ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋ｔｈｅｒａｐｉｅｓ［Ｊ］．邋ＦＩＯＯＯＲｅｓ，邋２０１７，邋６：邋９２７）邋［４５］0逡逑听力损失与带状突触逡逑宄认为，带状突触的损伤在噪音性听力损失中可能起到强度声音暴露后可以产生暂时性的听力阈移。对小鼠进，短期内毛细胞和螺旋神经节细胞没有发生明显改变，小Ｐ幅值下降，突触数目明显减少，形态异常，脱离噪声环恢复正常，但是ＣＡＰ幅值和突触数目并未完全恢复，而旋神经节细胞也会出现损失［４６；４８；４９］。此外，Ｓｈｉ等对豚鼠伤的突触可以部分修复，但是再生的突触在时相处理等功考虑到低强度噪音在现代生活中相对较多的接触机会，可能逐累，导，
时基底膜也出现了不同程度的萎缩。不同位置的毛细胞对于链霉素的反应也不同。逡逑相同浓度下，底回毛细胞对于链霉素最敏感，损伤最重，中回次之，顶回则无明逡逑显变化（图１）。逡逑随着链霉素浓度的升高，毛细胞缺失比例也逐渐严重。统计分析发现，链逡逑霉素浓度越高，内毛细胞和外毛细胞的损伤程度越重。除顶回外，ｌｍｇ／ｍｌ链霉逡逑素即可引起内毛细胞明显缺失，２ｍｇ／ｍｌ及更高浓度链霉素可引起外毛细胞明显缺逡逑失（Ｐ＜０．０５）。相同位置和相同浓度链霉素作用下，内毛细胞和外毛细胞的缺失逡逑情况则无明显差异（办0．0５）（图１）。逡逑根据以上结果，后续实验中损伤基底膜时使用的链霉素浓度被确定为逡逑２ｍｇ／ｍｌ0逡逑１．２链霉素对于ＨＥ卜０Ｃ１细胞的损伤逡逑本研宄通过ＭＴＴ法检测不同浓度的链霉素对于连续培养的ＨＥＩ－ＯＣ１细胞的逡逑损伤作用。试验中选取了邋１邋ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１邋Ｏｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、逡逑３０ｍｇ／ｍｌ和４０ｍｇ／ｍｌ共计８个不同浓度。以１５ｍｇ／ｍｌ链霉素为例，药物处理２４ｈ逡逑后可以看到ＨＥＩ－０Ｃ１细胞数目明显减少，胞体明显萎缩，细胞核皱缩，形成空逡逑泡样的外观
逑相比明显下降（户＜０．０５），５ｍｇ／ｍｌ链霉素存活率降至７８．３３±２．４０％，１５ｍｇ／ｍｌ链逡逑霉素存活率降至４５．１５６士８．００％邋（图２Ｂ）。逡逑根据以上结果，考虑到药物损伤是逐渐进展的过程，５ｍｇ／ｍｌ浓度的链霉素逡逑己可引起相应的基因及蛋白改变，更高浓度的链霉素的损伤较重，可能引起其他逡逑细胞死亡相关通路的改变，本实验后续损伤ＨＥＩ－ＯＣ１细胞的链霉素浓度被确定逡逑为邋５ｍｇ／ｍｌ0逡逑Ａｐｅｘ逦Ｍｉｄ逦Ｂａｓｅ逡逑Ｏｍｏｍｌ逡逑一逡逑ｓ邋｜Ｍ逦ＩＮ逦Ｏ逦ｎ0Ｈｒ逡逑＂ｃ邋ｌｏｏｊ邋Ｔｉ—■逦ｌ0？－｜邋Ｔ邋Ｔ逦ｌ，Ｍ，－邋Ｔ邋＊ｒ逦ＣＱＩＨＣ逡逑＿Ｐ邋＿邋Ｓ媝说逦媝ｉ逦■．逡逑：ｉＭｊｍ丨W＿，邋＿邋＿丨X樱呶义希埃恚箦澹恚戾澹欤恚珏澹恚戾澹玻恚辏ǎ恚戾澹担恚澹恚戾危希恚铄澹恚戾澹桑恚辏螅В恚戾澹玻恚隋澹恚戾澹担恚椋翦澹恚戾
本文编号：2809132
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R764
【部分图文】：
图２．内毛细胞带状突触模式图逡逑考文献（Ｌｉｂｅｒｍａｎ邋Ｍ邋Ｃ．邋Ｎｏｉｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ａｎｄ邋ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ邋ｈｅａｒｉｓ邋ａｎｄ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋ｔｈｅｒａｐｉｅｓ［Ｊ］．邋ＦＩＯＯＯＲｅｓ，邋２０１７，邋６：邋９２７）邋［４５］0逡逑听力损失与带状突触逡逑宄认为，带状突触的损伤在噪音性听力损失中可能起到强度声音暴露后可以产生暂时性的听力阈移。对小鼠进，短期内毛细胞和螺旋神经节细胞没有发生明显改变，小Ｐ幅值下降，突触数目明显减少，形态异常，脱离噪声环恢复正常，但是ＣＡＰ幅值和突触数目并未完全恢复，而旋神经节细胞也会出现损失［４６；４８；４９］。此外，Ｓｈｉ等对豚鼠伤的突触可以部分修复，但是再生的突触在时相处理等功考虑到低强度噪音在现代生活中相对较多的接触机会，可能逐累，导，
时基底膜也出现了不同程度的萎缩。不同位置的毛细胞对于链霉素的反应也不同。逡逑相同浓度下，底回毛细胞对于链霉素最敏感，损伤最重，中回次之，顶回则无明逡逑显变化（图１）。逡逑随着链霉素浓度的升高，毛细胞缺失比例也逐渐严重。统计分析发现，链逡逑霉素浓度越高，内毛细胞和外毛细胞的损伤程度越重。除顶回外，ｌｍｇ／ｍｌ链霉逡逑素即可引起内毛细胞明显缺失，２ｍｇ／ｍｌ及更高浓度链霉素可引起外毛细胞明显缺逡逑失（Ｐ＜０．０５）。相同位置和相同浓度链霉素作用下，内毛细胞和外毛细胞的缺失逡逑情况则无明显差异（办0．0５）（图１）。逡逑根据以上结果，后续实验中损伤基底膜时使用的链霉素浓度被确定为逡逑２ｍｇ／ｍｌ0逡逑１．２链霉素对于ＨＥ卜０Ｃ１细胞的损伤逡逑本研宄通过ＭＴＴ法检测不同浓度的链霉素对于连续培养的ＨＥＩ－ＯＣ１细胞的逡逑损伤作用。试验中选取了邋１邋ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１邋Ｏｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、逡逑３０ｍｇ／ｍｌ和４０ｍｇ／ｍｌ共计８个不同浓度。以１５ｍｇ／ｍｌ链霉素为例，药物处理２４ｈ逡逑后可以看到ＨＥＩ－０Ｃ１细胞数目明显减少，胞体明显萎缩，细胞核皱缩，形成空逡逑泡样的外观
逑相比明显下降（户＜０．０５），５ｍｇ／ｍｌ链霉素存活率降至７８．３３±２．４０％，１５ｍｇ／ｍｌ链逡逑霉素存活率降至４５．１５６士８．００％邋（图２Ｂ）。逡逑根据以上结果，考虑到药物损伤是逐渐进展的过程，５ｍｇ／ｍｌ浓度的链霉素逡逑己可引起相应的基因及蛋白改变，更高浓度的链霉素的损伤较重，可能引起其他逡逑细胞死亡相关通路的改变，本实验后续损伤ＨＥＩ－ＯＣ１细胞的链霉素浓度被确定逡逑为邋５ｍｇ／ｍｌ0逡逑Ａｐｅｘ逦Ｍｉｄ逦Ｂａｓｅ逡逑Ｏｍｏｍｌ逡逑一逡逑ｓ邋｜Ｍ逦ＩＮ逦Ｏ逦ｎ0Ｈｒ逡逑＂ｃ邋ｌｏｏｊ邋Ｔｉ—■逦ｌ0？－｜邋Ｔ邋Ｔ逦ｌ，Ｍ，－邋Ｔ邋＊ｒ逦ＣＱＩＨＣ逡逑＿Ｐ邋＿邋Ｓ媝说逦媝ｉ逦■．逡逑：ｉＭｊｍ丨W＿，邋＿邋＿丨X樱呶义希埃恚箦澹恚戾澹欤恚珏澹恚戾澹玻恚辏ǎ恚戾澹担恚澹恚戾危希恚铄澹恚戾澹桑恚辏螅В恚戾澹玻恚隋澹恚戾澹担恚椋翦澹恚戾
本文编号：2809132
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yank/2809132.html
最近更新
教材专著
