第一部分大鼠耳蜗血管纹边缘细胞的原代培养及葡萄糖氧化酶诱导的氧化应激模型的建立目的:大鼠耳蜗血管纹边缘细胞(marginal cells,MCs)的原代培养及葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GO)诱导的MCs氧化应激模型的建立。方法:取SD大鼠乳鼠(3日龄),麻醉断头后,在解剖显微镜下分离去除两侧的颞骨,可见透明的骨性耳蜗,并分离出耳蜗侧壁的血管纹组织。经酶消化后加入血清浓度为2%的动物上皮细胞培养基中,接种于细胞培养板并置于37℃,5%CO_2的培养箱中培养。经选择性消化和差速贴壁方法纯化MCs后,用倒置显微镜每日观察MCs形态并采用免疫荧光的方法鉴定MCs。将MCs置于新鲜动物上皮细胞培养基中并加入5 mM葡萄糖(glucose,G),分别用不同浓度的GO处理,用CCK-8试剂盒筛选出最适宜的作用浓度。再分别用相同浓度的GO处理MCs不同的时间,用CCK-8试剂盒筛选出最适宜的作用时间。为进一步验证氧化应激模型的建立,通过流式细胞仪检测相同浓度的GO不同时间点下MCs内的ROS水平。结果:倒置显微镜下观察到MCs贴壁生长,多角形外观,排列紧密,界限清晰,呈现单层“铺路石样”外观。免疫荧光方法检测MCs内角蛋白18(CK-18)阳性。CCK-8检测结果显示GO浓度大于20 U/L时能够引起MCs活性下降,GO浓度处于20-50 U/L之间时虽然能够导致MCs活性下降,但没有统计学意义,GO浓度为60 U/L时显著降低MCs活性(P﹤0.01),因此选用60 U/L GO处理MCs。用60 U/L的GO分别干预MCs 0 h、2 h、4 h、6 h及8 h,MCs活性逐渐降低,但2 h组较对照组相比无统计学意义,4 h组较对照组相比有统计学意义(P﹤0.01),6 h组和8 h组虽然也具有统计学意义,但MCs活性较低,状态较差。因此后续实验选用60 U/L的GO干预MCs 4h。用60 U/L GO处理MCs,流式细胞仪检测结果显示MCs内ROS水平呈时间依赖性升高。结论:成功的培养出大鼠耳蜗血管纹MCs,得到较高纯度的MCs。用60 U/L GO作用于MCs 4 h后建立了体外MCs氧化应激模型。第二部分葡萄糖氧化酶诱导边缘细胞Parthanatos目的:研究PARP-1在葡萄糖氧化酶(GO)诱导的耳蜗血管纹边缘细胞(MCs)氧化应激损伤中的作用及其可能的分子机制。方法:将MCs置于新鲜动物上皮细胞培养基中并加入5 m M葡萄糖(G),用60 U/L GO处理纯化后的MCs,通过Western blot和免疫荧光的方法检测MCs内PAR蛋白水平和表达分布情况、线粒体凋亡诱导因子AIF胞内表达变化以及PARP-1的表达变化。通过JC-1染色检测线粒体膜电位(MMP)的变化情况。通过PARP-1 si RNA转染下调PARP-1的表达来明确PARP-1在葡萄糖氧化酶诱导的边缘细胞Parthanatos中的作用,转染MCs(MOI=30)后将分为以下四组:对照组、GO、GO+Ad-Con、GO+Ad-PARP-1-RNAi。通过Annexin V/PI双染检测MCs的死亡情况。结果:Western blot结果显示,随着GO处理时间的延长,MCs内PAR蛋白水平依次增加,免疫荧光结果显示GO处理组的MCs内PAR表达水平增加,且主要表达于细胞质。与对照组相比,GO处理组的MCs内AIF线粒体蛋白水平降低(P﹤0.05),细胞浆和细胞核内AIF蛋白水平升高(P﹤0.01,P﹤0.05);PARP-1在线粒体、细胞浆和细胞核内蛋白水平升高(P﹤0.01,P﹤0.05,P﹤0.05);免疫荧光结果显示GO处理组的MCs核内AIF水平升高,发生了细胞核转位;JC-1染色结果显示GO处理组的MCs内MMP随着GO处理时间的增加不断下降,导致了线粒体去极化;流式细胞仪结果显示PARP-1 si RNA转染MCs后,与GO+Ad-Con组相比,GO+Ad-PARP-1-RNAi组的PI阳性率降低(P﹤0.05);MMP升高(P﹤0.01);PAR蛋白表达水平降低(P﹤0.05);AIF在线粒体内的蛋白表达水平升高(P﹤0.05),在细胞浆和细胞核内蛋白表达水平降低(P﹤0.05,P﹤0.05);PARP-1在线粒体、细胞浆和细胞核内蛋白表达水平降低(P﹤0.01,P﹤0.05,P﹤0.05);与GO+Ad-Con组相比,免疫荧光结果显示GO+Ad-PARP-1-RNAi组AIF没有出现明显的细胞核转位现象。结论:在GO诱导的耳蜗血管纹MCs氧化应激损伤过程中PARP-1明显激活,PAR积聚,AIF由线粒体向细胞核的转位,MMP明显下降,诱导了MCs Parthanatos;PARP-1 si RNA转染可抑制MCs Parthanatos,明确了PARP-1在GO诱导的MCs Parthanatos中的重要作用。第三部分探讨PARP-1对葡萄糖氧化酶诱导的自噬的调节以及自噬对边缘细胞Parthanatos的影响目的:探讨葡萄糖氧化酶(GO)是否能够诱导自噬的表达,PARP-1是否参与自噬的调节以及自噬对GO诱导的MCs Parthanatos的影响。方法:将MCs置于新鲜动物上皮细胞培养基中并加入5 m M葡萄糖(G),用60 U/L GO处理纯化后的MCs,在不同的时间点通过Western blot检测自噬标志性蛋白LC3和P62表达水平的变化;用60 U/L GO处理纯化后的MCs之前,给予自噬抑制剂3-MA 10m M,通过Western blot和免疫荧光的方法检测自噬流的变化,给予自噬抑制剂3-MA后将分为以下四组:对照组、3-MA组、GO组、GO+3-MA组;通过PARP-1 si RNA转染下调PARP-1的表达明确PARP-1是否参与自噬的调控,通过Western blot检测自噬标志性蛋白LC3和P62表达水平的变化,转染MCs后将分为以下四组:对照组、GO组、GO+Ad-Con、GO+Ad-PARP-1-RNAi;通过Annexin V/PI双染检测MCs死亡情况;通过JC-1染色检测线粒体膜电位(MMP)的变化情况;通过Western blot检测PAR蛋白表达变化;通过Western blot检测AIF和PARP-1分别在线粒体、细胞浆和细胞核内蛋白表达变化。结果:Western blot结果显示,随着GO处理时间的延长,LC3-Ⅱ的表达水平逐渐增加,P62的表达水平逐渐降低;Western blot结果显示,与GO组相比,GO+3-MA组的LC3-Ⅱ的蛋白表达水平降低(P﹤0.05),P62的蛋白表达升高(P﹤0.05),免疫荧光检测结果显示,与GO组相比,GO+3-MA组的LC3斑点状荧光明显减少;Western blot结果显示,与GO+Ad-Con组相比,GO+Ad-PARP-1-RNAi组的LC3-Ⅱ的表达水平降低(P﹤0.05),P62的表达水平增加(P﹤0.05);与GO组相比,流式细胞仪结果显示,GO+3-MA组的PI阳性率升高(P﹤0.05),MMP降低(P﹤0.01);PAR蛋白表达水平升高(P﹤0.05);AIF在线粒体内的蛋白表达水平降低(P﹤0.05),在细胞浆和细胞核内蛋白表达水平升高(P﹤0.05,P﹤0.05);PARP-1在线粒体、细胞浆和细胞核内蛋白表达水平升高(P﹤0.05,P﹤0.05,P﹤0.05)。结论:GO处理MCs能够诱导自噬增加;PARP-1 si RNA转染下调PARP-1的表达能够抑制自噬表达;抑制自噬可促进MCs Parthanatos,说明自噬在在GO诱导的耳蜗血管纹MCs氧化应激损伤过程中起着保护性作用。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R764
【部分图文】：
华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文实验结果MCs 形态学观察镜下可见原代培养的耳蜗血管纹 MCs。贴壁后的 MCs 呈多角形，细胞离，大小不一，彼此界限清楚。细胞之间紧密连接，细胞相互融合成排皮层，呈“铺路石”样的外观。随着培养天数的增加，MCs 体积逐渐增多，呈“泡沫样”的外观，胞核变淡，胞质中可见颗粒样的物质。可的形成。
MCs的鉴定CK-18在MCs内表达阳性
华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文．GO 处理之后 MCs 的活性了筛选出适宜的 GO 作用浓度，用加入 5 mM 葡萄糖的新鲜培养基配置 GO,其浓度分为 0 U/L, 10 U/L, 20 U/L, 30 U/L, 40 U/L, 50 U/L, 60 U/L, 70 U/L, 80 U/ 100 U/L，干预 4 h，干预结束后通过 CCK-8 检测 MCs 活性。如图 3A 所示，GO 浓大于 20 U/L 时能够引起 MCs 活性下降，GO 浓度处于 20-50 U/L 之间时虽然能够导 MCs 下降，但没有统计学意义，GO 浓度为 60 U/L 时显著降低 MCs 活性（P﹤0.01）续实验我们选用 60 U/L 的 GO 干预 MCs。如图 3B 所示，随着 GO 作用时间的延长，Cs 活性逐渐降低，但 2 h 组较对照组相比无统计学意义，4 h 组较对照组相比有统学意义（P﹤0.01），6 h 组和 8 h 组虽然也具有统计学意义，但细胞活性较低，状较差。因此后续实验选用 60 U/L 的 GO 干预 MCs 4 h。
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本文编号：
2845782
