ERK2与EYA3基因对视网膜母细胞瘤细胞生长的影响

发布时间：2020-10-23 14:26

　　 目的细胞外信号调节激酶2(Extracellular signal regulated kinase,ERK2)和眼缺失基因3(eyes absent,EYA3)与恶性肿瘤的发生发展密切相关,但其调控视网膜母细胞瘤发生发展的机制尚不十分明确。为了进一步探索它们在视网膜母细胞瘤发生发展中所起到功能及作用,本实验分别构建Myc-ERK2和EYA3小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,并利用生长曲线检测其对人视网膜母细胞瘤(WERI-Rb-1)细胞生长的影响。有望为视网膜母细胞瘤的发生发展提供有价值的理论依据。方法采用PCR技术从本实验室保存的人乳腺文库中扩增目的基因ERK2序列,并将其正确插入到Myc载体中。将Myc空载体和Myc-ERK2重组质粒转染HEK293T细胞,利用Western blot印迹来检测表达情况,通过生长曲线实验检测ERK2对视网膜母细胞瘤(WERI-Rb-1)细胞生长的影响。然后,根据EYA3的cDNA序列,设计并构建EYA3 siRNA真核表达载体。将EYA3 siRNA重组质粒转染HEK293T细胞后,通过利用RT-PCR和Western blot印迹实验分别检测EYA3基因的表达水平。将构建的EYA3 siRNA重组质粒稳定转染WERI-Rb-1细胞,并利用生长曲线检测EYA3对WERI-Rb-1细胞生长的影响。结果成功获得了Myc-ERK2和EYA3小干扰RNA(siRNA)的重组质粒。通过双酶切和测序鉴定表明,Myc-ERK2真核表达质粒构建成功,Western blot印迹表明Myc-ERK2在HEK293T细胞中成功表达,细胞生长曲线实验表明Myc-ERK2对WERI-Rb-1细胞的生长具有促进作用。通过RT-PCR和Western印迹分别检测EYA3基因的表达,说明构建的EYA3 siRNA能够抑制EYA3基因的表达,细胞生长曲线实验表明EYA3 siRNA对WERI-Rb-1细胞的生长具有抑制作用。结论本实验成功获得了Myc-ERK2和EYA3 siRNA的重组质粒。通过本实验可以得出结论:ERK2能够促进WERI-Rb-1细胞的生长,敲低EYA3能够抑制WERI-Rb-1细胞的生长。本实验为进一步探究ERK2和EYA3在视网膜母细胞瘤中的功能奠定了基础,为后续研究视网膜母细胞瘤的发生发展机制提供新的理论平台。
【学位单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.7
【部分图文】：

ERK2 基因的琼脂糖凝胶电: DNA marker；1: ERK2 PCR 产质粒的构建与鉴定双酶切的 PCR 产物和 Myc 载组质粒双酶切鉴定，凝胶电泳功插入到 Myc 标签中。测序结K2 构建成功。

ERK2 基因的琼脂糖凝胶电: DNA marker；1: ERK2 PCR 产质粒的构建与鉴定双酶切的 PCR 产物和 Myc 载组质粒双酶切鉴定，凝胶电泳功插入到 Myc 标签中。测序结K2 构建成功。

2和空载体分别转染HEK293T24h 后收取培养皿中的细胞 Sc-ERK2 蛋白的表达。通过上述K2 后，实验结果与预期一致，量约 4.3×104处可见明显特异性胞中正确表达（图 3）。
【参考文献】

相关博士学位论文 前1条

1 刘燕;MEK/ERK信号传导通路在缺氧诱导的外层血—视网膜屏障损伤中的作用[D];中南大学;2012年

本文编号：2853153