FAP在眼睑基底细胞癌及良性肿瘤相关成纤维细胞中的表达及作用研究

发布时间：2020-10-31 23:57

　　 目的:通过原代细胞培养、分离,获得纯化的眼睑基底细胞癌相关成纤维细胞(CAFs)、眼睑良性肿瘤皮内痣相关成纤维细胞(BAFs)及正常眼睑皮肤成纤维细胞(NFs),并检测三种不同成纤维细胞表达成纤维活化蛋白(FAP)的差异,进一步探讨CAFs表达FAP在眼睑基底细胞癌中的作用及意义。方法:(1)用组织块贴壁法培养获得原代眼睑基底细胞癌CAFs、眼睑良性肿瘤皮内痣相关成纤维细胞(BAFs)及眼睑正常皮肤NFs,胰酶差速消化法和反复传代培养法进行细胞分离、纯化;(2)在倒置相差显微镜下观察CAFs、BAFs及NFs细胞形态,运用免疫细胞组织化学染色法检测三种成纤维细胞中波形蛋白(VIM)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、细胞角蛋白(CK)及FAP表达情况并对其进行鉴定;(3)采用MTT比色法检测3种细胞的生长增殖活力并绘制生长曲线;通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)法检测CAFs、BAFs及NFs细胞中FAP的mRNA表达差异;应用蛋白免疫印迹(Western Blot)方法检测CAFs、BAFs及NFs中FAP蛋白表达差异。结果:(1)成功获得纯化的眼睑CAFs、BAFs及NFs。(2)眼睑CAFs呈纺锤形或长梭形,细胞大小不一,胞质突减少,胞浆内较多颗粒,增殖较快,排列紊乱不规则,重叠生长现象明显,丧失接触抑制现象;BAFs生长速度介于CAFs与NFs之间,细胞多数呈长梭形,放射状排列,可有重叠生长现象,部分接触抑制作用丧失;NFs呈长梭形,放射状排列,增殖速度较CAFs及BAFs慢,胞浆内颗粒少见,无重叠生长现象,存在接触抑制。(3)细胞免疫化学染色,CAFs组VIM(+)、α-SMA(+)、FAP(+),CK(-);BAFs组VIM(+),α-SMA和FAP表达阴性或弱阳性,CK(-);NFs组VIM(+),CK(-)、α-SMA(-)及FAP(-)。(4)RTQ-PCR法检测CAFs、BAFs、NFs三种不同组织来源的成纤维细胞FAP mRNA扩增含量分别为:3.6715±0.2212,1.4810±0.0904,1.0340±0.0236,用ONE-WAY ANOVA中SNK法进行统计检验,差异具有统计学意义(F=103.676,P0.005)。Western Blot法检测3组细胞中FAP蛋白表达水平,与其内参蛋白相比较,显示CAFs高表达FAP蛋白,BAFs不表达或弱表达,NFs组不表达,存在明显差异。结论:肿瘤微环境在肿瘤发生发展中起着重要作用,其微环境中成纤维细胞在形态、结构、分泌功能等方面发生了变化。眼睑基底细胞癌CAFs、眼睑良性肿瘤BAFs及眼睑正常皮肤NFs生物学特性(如形态结构、生长增殖、生长因子表达等方面)存在显著差异。提示眼睑基底细胞癌肿瘤微环境发生了变化,进一步诱导NFs生物学特性和功能发生变化,转变为BAFs及CAFs。CAFs、BAFs及NFs中FAP表达差异显著,且与肿瘤恶性程度相关,提示FAP在眼睑基底细胞癌中可能发挥着重要作用,可作为眼睑基底细胞癌诊断和治疗的一个新的靶点,但其具体作用机制有待进一步深入研究。
【学位单位】：川北医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.71
【部分图文】：

CAFs BAFs NFs图 1 患者标本来源图片注：从左往右依次为 CAFs、BAFs 及 NFs 标本来源CAFs BAFs NFs图 2 细胞培养（倒置相差显微镜观察）注：从左往右依次为 CAFs、BAFs、NFs；基底细胞癌 CAFs 从组织块边缘呈放射状爬出，细胞排列较紧密，出现重叠现象（×100）；BAFs 从组织块边缘呈放射状爬出，细胞较散在，有部分重叠现象（×100）；NFs 从组织块边缘散在爬出，细胞排列较松散，紧密接触不明显（×100）。

CAFs BAFs NFs图 2 细胞培养（倒置相差显微镜观察）注：从左往右依次为 CAFs、BAFs、NFs；基底细胞癌 CAFs 从组织块边缘呈放射状爬出，细胞排列较紧密，出现重叠现象（×100）；BAFs 从组织块边缘呈放射状爬出，细胞较散在，有部分重叠现象（×100）；NFs 从组织块边缘散在爬出，细胞排列较松散，紧密接触不明显（×100）。

32图 3 免疫细胞化学染色第 3 代 CAFs 免疫细胞化学染色 CK 阴性（SPx400）, VIM、α-SMA、FAP 均阳性（SPx400）； 代 BAFs 免疫组化染色 VIM 阳性（SPx400），CK 阴性（SPx400），α-SMA、FAP 阴性或性（SPx400）；第 3 代 NFs 免疫细胞化学染色仅 VIM 阳性（SPx400），CK、α-SMA、FAP性（SPx400）。
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 王晓翊;韩方;唐慧娟;王泽华;;卵巢癌相关成纤维细胞和正常卵巢成纤维细胞的基因表达差异[J];中国妇幼保健;2011年06期

本文编号：2864703