双调蛋白对近视豚鼠生物学参数的影响暨临床遗传学研究

发布时间：2020-11-02 14:13

　　目的:通过临床高度近视流行病学调查,分析高度近视屈光度及眼参数的分布情况,对高度近视人群进行基因检测,探讨高度近视的发病机制及易感基因在高度近视人群中的变异频率;研究负透镜诱导型近视豚鼠玻璃体腔注射(Amphiregulin AREG)抗体和正常豚鼠玻璃体腔注射AREG蛋白对豚鼠眼球生物学参数的影响,探讨AREG在近视疾病中的作用及近视的发病机制。方法:实验包括3部分,第1部分:高度近视的遗传流行病临床研究,在征得患者知情同意后,对2016年5月至2017年12月就诊的200例近视患者进行包括视力、屈光度、眼压、眼轴、角膜曲率、眼底等眼科专科检查,根据纳入和排除标准,筛选出高度近视患者170例,填写关于家庭成员近视情况的调查问卷,抽取5-6ml血液进行基因测序,观察近视易感基因的突变频率,进行高度近视的相关因素分析。第2部分:探讨玻璃体腔注射AREG抗体对负透镜诱导型近视豚鼠眼球生物学参数的影响。选取60只2周龄健康三色短毛豚鼠,随机分为5组,每组12只:正常对照组、近视组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,除正常对照组,其余组豚鼠均右眼佩戴-10D透镜2周,第三周开始近视组右眼注射linger液3ul,低剂量组、中剂量组、高剂量组豚鼠右眼分别玻璃体腔注射AREG抗体5ug、10ug、15ug,每周1次,连续注射3周,期间连续佩戴眼镜,对侧眼与正常对照组均不做任何处理。每周测量各组豚鼠的屈光度、眼轴长度,常规处死,取视网膜组织、实时荧光定量PCR测量豚鼠视网膜AREG mRNA的表达含量、免疫荧光染色法观察AREG蛋白在视网膜的分布情况,PAS染色法(Periodic Acid-Schiff stain)测量后极部巩膜厚度。第3部分:探讨正常豚鼠玻璃体腔注射AREG蛋白对眼球生物学参数的影响。选取选取48只2周龄健康三色短毛豚鼠,随机分为4组,每组12只:正常组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,第2周开始低剂量组、中剂量组、高剂量组豚鼠右眼分别玻璃体腔注射AREG蛋白50ng、100ng、200ng,左眼注射等量linger液,每周1次,连续注射4周,正常组不做任何处理。每周测量屈光度和眼轴长度,常规处死,取视网膜、实时荧光定量PCR测量豚鼠视网膜AREG mRNA的表达含量、免疫荧光染色法观察AREG蛋白在视网膜的分布情况,PAS染色法观察各组后极部巩膜厚度。结果:1.本研究高度近视人群视力为(0.05±0.04),屈光度为(-8.02±2.23)D,眼轴长度为(26.65±1.31)mm;均表现角膜曲率增加(43.11±1.47)D,角膜变凸,前房加深(3.76±0.27)mm,眼压未见明显异常(15.88±2.34)mmHg。.2.在高度近视人群中主要以眼轴增长的轴性高度近视为主,具有后发性、散发性的特点,随着年龄的增长,屈光度持续下降和眼轴过度延长,近视进行性加深,发生高度近视视网膜病变的几率增大。3.AREG在高度近视人群中变异频率增加,与屈光性高度近视人群相比,轴性高度近视患者的AREG基因变异频率更高。AREG主要在中国和东亚地区变异频率较高,在欧洲人群变异频率低,高度近视基因变异具有遗传性和种族特异性。4.与正常豚鼠比较,近视豚鼠的视网膜中AREG蛋白和mRNA表达增高。5.AREG广泛分布于视网膜组织,在眼球从赤道部到后极部的部位均有分布,负透镜诱导型近视豚鼠玻璃体腔注射AREG抗体,能够抑制近视眼轴增长和屈光度下降,呈剂量依赖性;抑制视网膜AREG蛋白和mRNA的表达,呈剂量依赖性;抑制后极部巩膜变薄,与近视组比较,三个注射组后极部巩膜厚度均增加,尤其是低剂量组和中剂量组(p0.05)。6.正常豚鼠玻璃体腔注射AREG蛋白能够增加后极部视网膜AREG蛋白的表达,AREG mRNA表达影响较小,豚鼠的眼球屈光度下降和眼轴增长程度较轻;病理切片PAS染色结果显示豚鼠眼球后极部出现巩膜变薄。结论:1.高度近视以眼轴增长的轴性高度近视为主,眼轴过度增长对视力危害大,易引起眼底改变和病变。2.高度近视人群中AREG基因变异频率增加,轴性高度近视的变异频率更高。3.负透镜诱导型近视豚鼠玻璃体腔注射AREG抗体能够抑制近视疾病的进展,但正常豚鼠玻璃体腔注射AREG蛋白能够在一定程度上诱导近视,我们认为AREG对近视发生发展有着重要作用,但AREG在近视发病机制中的作用需要进一步研究。
【学位单位】：山东中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R778.11
【部分图文】：

豚鼠,屈光度,负透镜,视网膜

图 1 Western Blot 蛋白印记法和实时荧光定量 PCR 法分别测量负透镜诱导型近视豚鼠与正常豚鼠视网膜 AREG 蛋白（A）和 mRNA（B）表达2. 屈光度及眼轴长度2.1 入组前屈光度及眼轴长度入组前各组豚鼠的初始屈光度及眼轴长度进行组间独立样本t检验比较差异均无统计学意义，各组豚鼠组内左眼、与右眼进行屈光度和眼轴长度进行配对 t 检验差异均无统计学意义。（均为 P>0.05）；2.2 近视模型屈光度及眼轴长度透镜诱导 2 周后，与正常对照组比较，各负透镜诱导的近视豚鼠屈光度下降和眼轴延长差异均有统计学意义，近视组屈光度和眼轴长度（t=4.168，p=0.004；t=-2.574，p=0.034）；低剂量组屈光度和眼轴长度（t=3.791，p=0.015；t=-6.765，p=0.000）；中剂量组屈光度和眼轴长度（t=4.495，p=0.005；t=-2.929，p=0.023）；高剂量组屈光度

屈光度,双眼,抗体,差值

玻璃体腔注射 AREG 抗体 3 次后，与近视组豚鼠双眼屈光度和眼轴长度差值比较（右眼减左眼），低剂量组、中剂量组、高剂量组与近视组比较眼轴长度呈剂量依赖性缩短，差异具有统计学意义（t=3.426，p=0.011；t=4.143，p=0.004；t=5.815，p=0.001），屈光度呈剂量依赖性上升，其中高剂量组屈光度差异具有统计学意义（t=-0.780，p=0.458；t=-2.004，p=0.083；t=-5.028，p=0.001）（见图 2）。表 2 玻璃体腔注射 AREG 抗体 3 次后左右眼屈光度和眼轴长度差值（ x ± s）分组屈光度( /D) 眼轴长度(ι/mm)正常对照组 -0.75±0.73 -0.03±0.02近视组 -3.70±1.07 0.25±0.06低剂量组 -3.20±0.96 0.14±0.04**中剂量组 -2.10±1.43 0.07±0.08**高剂量组 -0.55±0.91** -0.01±0.08**注：*表示与近视组屈光度和眼轴差值比较差异（P<0.05）；**表示与近视组屈光度和眼轴差值比较差异（P<0.01）

蛋白,豚鼠