rno-mir-30b-5p对葡萄膜炎大鼠白介素-10、Toll样受体4表达的调控作用及临床研究

发布时间：2020-11-03 03:43

　　目的1.研究自身免疫性葡萄膜炎患者外周血T淋巴细胞中miR-30b-5p的表达水平以及白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)、Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR 4)mRNA和蛋白的表达水平变化,进而探讨miR-30b-5p、IL-10和TLR 4在葡萄膜炎发病中的作用机制。2.研究在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠模型中rno-miR-30b-5p在眼球、脾脏和淋巴结组织中的表达水平改变及IL-10和TLR4mRNA和蛋白的表达水平改变与葡萄膜炎之间的关系;探讨EAU大鼠脾脏和淋巴结T细胞中加入rno-miR-30b-5p模拟剂和抑制剂干预后IL-10,TLR4表达失衡与EAU发生之间的关系。方法1.收集处于活动期的前葡萄膜炎患者及健康人群外周血4ml,分离收集外周血T淋巴细胞,采用实时荧光定量PCR检测miR-30b-5p、IL-10和TLR4的基因表达变化;ELISA检测血清中IL-10、TLR4的蛋白浓度变化;2.对IL-10、TLR4基因序列及载体序列进行分析后,通过PCR扩增获得IL-10、TLR4基因的3’UTR序列;在野生型(WT)载体基础上,以IL-10、TLR4基因的3′UTR序列为模板,在引物上引入突变碱基,获得定点突变序列。将野生型和突变型(Mut)目的基因片段分别克隆到pmiR-RB-REPORT?双荧光素酶报告载体中,成功构建质粒载体和突变质粒载体;同时,将rno-miR-30b-5p mimic与构建好的报告基因载体共转染293T细胞,通过报告基因相对荧光值的表达改变分析rno-miR-30b-5p与靶基因之间是否存在调控作用关系;3.随机挑选6~8周龄雌性Lewis大鼠分为正常对照组和EAU组,每组各6只,其中EAU组大鼠注射光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP_(1177-1191))、完全弗氏佐剂(CFA)、结合菌素(TB)和PBS300μl乳糜液以诱导EAU模型,正常对照组大鼠相同部位注射等量不含IRBP的乳化液。免疫后每天用Genesis-D眼部照相机观察EAU大鼠眼部炎症变化,并进行临床评分。当EAU大鼠在第12天达到炎症达高峰期时,过量麻醉处死大鼠,摘取大鼠眼球分别进行HE病理染色,比较大鼠眼组织病理学差异;PCR检测rno-miR-30b-5p的表达。同时分离淋巴结和脾脏组织,通过PCR检测rno-miR-30b-5p和IL-10、TLR4基因的表达变化,ELISA检测IL-10和TLR4蛋白的表达变化。4.用大鼠淋巴细胞分离液分离收集EAU大鼠脾脏、淋巴结的T淋巴细胞,分别用促进和抑制rno-miR-30b-5p表达的rno-miR-30b-5p模拟剂(mimic)和拮抗剂(inhibitor)进行T细胞转染,通过流式细胞仪检测各组T细胞的IL-10、TLR4表达变化,PCR检测转染后各组T细胞中IL-10、TLR4基因的表达变化,ELISA检测转染后各组T细胞中IL-10和TLR4蛋白的表达变化。结果1.PCR检测发现:前葡萄膜炎患者活动期外周血T淋巴细胞中miR-30b-5p的表达水平升高,而IL-10和TLR4 mRNA出现明显的下调表达(均为P0.05);ELISA检测发现,血清中IL-10、TLR4蛋白水平也显著下调表达(均为P0.05);2.根据靶基因鉴定进行分析,发现rno-miR-30b-5p mimic对IL-10、TLR4野生型的报告荧光有明显的下调作用,对其预测靶位点进行突变后,突变型载体中的报告荧光也存在明显的下调作用;3.EAU大鼠免疫后第12天炎症达到高峰,组织病理学检查结果与眼底照相机观察眼前段炎性表现结果一致。PCR检测结果表明,rno-miR-30b-5p在EAU大鼠眼球、脾脏和淋巴结组织中呈明显的下调表达,而IL-10、TLR4 mRNA和蛋白呈显著的上调表达,与正常对照组相比,表达水平差异均具有统计学意义(均为P0.05)。4.体外细胞转染实验发现,与EAU对照组、模拟剂阴性对照(mimic Negative,mimic N)组相比,加入rno-miR-30b-5p mimic干预的脾脏和淋巴结组的IL-10、TLR4的基因和蛋白出现明显的下调表达;经rno-miR-30b-5p inhibitor干预后,淋巴结组中IL-10、TLR4 mRNA显著上调表达(均为P0.05);脾脏组中,TLR4 mRNA为显著上调表达(P0.05),而IL-10mRNA的上调表达不明显(P0.05);rno-miR-30b-5p inhibitor脾脏和淋巴结组中,IL-10、TLR4蛋白质的上调表达与EAU空白组、抑制剂阴性对照组(inhibitor Negative,inhibitor N)相比无统计学意义(均为P0.05)。流式细胞仪检测发现,与EAU对照组和mimic N比较,rno-miR-30b-5p mimic干预的脾脏和淋巴结组中IL-10,TLR4的阳性细胞数量明显降低(均为P0.05);而与EAU对照组和inhibitor N相比,rno-miR-30b-5p inhibitor干预的脾脏和淋巴结组的IL-10,TLR4的阳性细胞数量显著增加(均为P0.05)。结论1.前葡萄膜炎患者活动期外周血T淋巴细胞中高表达的miR-30b-5p,通过抑制IL-10和TLR4 mRNA和蛋白的表达,调控葡萄膜炎的发生发展;2.靶点鉴定实验进一步证实IL-10、TLR4是rno-miR-30b-5p调控的靶基因,rno-miR-30b-5p能够负调控IL-10、TLR4的表达,该研究为进一步探索microRNA在葡萄膜炎发生发展进程中的调控作用奠定了基础;3.动物实验和体外细胞转染实验研究发现,在EAU大鼠脾脏和淋巴结中,rno-miR-30b-5p能够显著下调IL-10和TLR4的基因的表达。因此,rno-miR-30b-5p可通过调控IL-10、TLR4表达水平,调控葡萄膜炎的发展进程。本研究为进一步探索microRNA在葡萄膜炎发生发展进程中的调控作用以及治疗葡萄膜炎奠定了基础。
【学位单位】：山东中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R773.9
【部分图文】：

外周血,患者,葡萄膜炎,健康人