慢性间歇性低氧大鼠肝脏脂质代谢异常的机制和N-acetylcysteine的治疗作用

发布时间：2020-11-06 05:02

　　 OSA_(Obstructive sleep apnea)是一种影响人类全身多系统的睡眠呼吸障碍性疾病,主要表现为睡眠打鼾及睡眠结构的紊乱、反复低氧血症。其解剖结构基础为上气道的阻塞和塌陷,病理生理基础是慢性间歇性缺氧/复氧(intermittent hypoxia/reoxygenation,IHR),导致夜间睡眠血氧不足,通过缺血-再灌注损伤引起氧自由基的产生,出现局部和全身性的炎症反应,从而引起肝、肺、心脑血管等损害。多年来的研究证实,OSA患者缺氧的严重程度与肝脏异常的脂质代谢、脂肪肝的形成及血脂升高密切相关。大量动物模型研究也表明,慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)可引起大鼠多个器官的损害。但其内在发病机制还不是很明确,其发生机制具有争议性,对其药物的治疗也不是很多见。本文旨在从分子、细胞层面探讨CIH对大鼠肝脏脂质代谢的影响及可能的损害机制,并加以药物干预,分析其作用机制,为临床治疗和预防OSA疾病提供理论依据。N-acetylcysteine(NAC,N-乙酰半胱氨酸)作为一种可以用于人体和动物的抗氧化剂,它不仅具有明显的抑制活性氧自由基的作用,同时也可以消除机体已存在的活性氧自由基,对于防止组织细胞损伤、改善细胞代谢活性、促进组织细胞功能的恢复具有较好的作用,从分子水平上有调控信号通路和基因表达的机制。对NAC的研究,目前主要集中在呼吸系统、心血管系统等方面,在肝脏等消化系统方面的作用,报道尚少。由于OSA对人体的影响是多系统的,CIH对动物的影响也是全面的,因而我们推测,CIH诱导下大鼠肝脏有可能会出现代谢异常和损害。由于NAC具有积极而广泛的治疗作用,我们同样推测它在肝脏方面也可能具有积极的保护和治疗作用。本实验就是主要探讨CIH下大鼠肝脏的损害机制和NAC的治疗作用。由于伦理道德因素的限制,是不可能以人本身作为实验对象的,而单纯靠临床知识和经验的积累,又有很大的局限性。因而,对实验动物的研究就显得非常重要。而要进行动物实验研究,建立合适有效的模型首当其冲。自1992年Fletcher第一次报道低氧-复氧大鼠模型以来,20多年间出现了多种多样的实验模型,各有各的特点,但仍处于不断探索和改进阶段。我们经过多年的实验积累和改进,在电子装备工程师的支持下,建立了一整套适合多种动物和细胞研究的CIH模型,帮助我们成功完成了包括本实验在内的多个实验研究。第一部分 慢性间歇性低氧动物模型的建立及意义目的选取大鼠为实验动物,建立慢性间歇性低氧动物模型,为OSA的基础研究提供一个可靠的实验平台。方法低氧舱系统的制备:采用彩色触摸屏、可编程逻辑控制器(Programmable Logic Controller,PLC)自动控制和自动数据采集监测系统,制造建立实验模型所需要的装备。低氧舱控制装置的主体设备主要由以下三个组成部分:主机部分、低氧舱体和气路控制部分。模型的建立:30只大鼠采用随机数字表法分成2组,每组15只,分别为常氧对照组(CON组)和慢性间歇性低氧模型组(CIH组)。CON组置于常氧对照舱。适应性饲养1周。置于同一实验环境,室温23℃,湿度50%,普通喂养。低氧舱设置为5%低氧浓度,低氧时间40秒(包括缓冲时间5秒),常氧时间40秒(包括缓冲时间5秒),以“低氧-常氧-低氧”模式循环进行,8小时/天,09:00-17:00,连续饲养9周。取材和标本的制备:普通喂养,9周后解剖所有大鼠,严格按照实验要求获取肝脏标本。进行油红“O”染色、HE染色、透射电镜观察。HE染色光镜下观察各组肝脏组织的形态学变化。透射电镜观察各组肝组织细胞的超微结构变化。油红“O”染色通过Image-pro Plus(IPP)细胞图像分析管理系统进行定量分析。结果1.形态学改变:CIH组的HE染色可见脂质积聚、脂肪空泡形成,导致肝细胞脂肪变性。电镜下超微结构见大量簇状脂滴、自噬小体和溶酶体大量出现、粗面内质网糖原的灶性聚积、毛细胆管微绒毛变得稀疏。CON组则很少见此征象,此模型下CIH组大鼠肝细胞形态学发生了明显改变。2.脂质油红“O”染色结果:红色颗粒为脂质样物。CON组与CIH组IOD/Area(有效统计区域面积内的累计光密度平均值)差异有统计学意义(P0.05)。CIH组肝细胞脂质明显染红,CON组肝细胞染红很轻微,说明模型造成了两组样本之间的差异。3.CIH动物模型建立的结果:通过CON组与CIH组大鼠肝脏细胞形态学方面的观察和研究,有明显的细胞受损方面的表现,支持CIH下肝组织出现功能障碍的体征。我们建立的此套CIH模型,运行良好。结论1.慢性间歇性低氧动物模型建立成功。2.此模型下的大鼠符合OSA的病理生理特点。3.此模型作为进一步研究OSA的实验平台是可靠有效的。第二部分 慢性间歇性低氧大鼠肝脏脂质代谢异常的发生机制和N-acetylcysteine 的治疗作用目的探讨CIH诱导的大鼠肝组织损害和肝脏脂质代谢障碍的可能的发病机制,N-acetylcysteine(NAC)对CIH大鼠模型下的异常肝脏脂质代谢可能的治疗作用。方法建立模型:60只大鼠采用随机数字表法分成4组,每组15只,分别为常氧对照组(CON组),慢性间歇性低氧模型组(CIH组),模型对照组(CIH+NS组),治疗组(CIH+NAC组)。适应性饲养1周。置于同一实验环境,室温23℃,湿度50%,普通喂养。低氧舱设置为5%低氧浓度,低氧时间40秒(包括缓冲时间5秒),常氧时间40秒(包括缓冲时间5秒),以“低氧-常氧-低氧”模式循环进行,8小时/天,09:00-17:00,连续饲养9周。治疗组于每日低氧前15分钟腹腔注射NAC+NS(20mg/Kg.d,1%),模型对照组注射同等体积的NS,连续9周。组织的制备和检测.:普通喂养,9周后分别取大鼠肝脏组织,严格按检测标本要求给予冷冻、固定等妥善处理。1.分别记录初始和终末体重(g),进行统计学比较。2.采用HE染色观察肝细胞的形态学改变。3.油红“O”染色观察肝脏脂质代谢的病理变化,Image-pro Plus(IPP)细胞图像分析管理系统进行定量分析。4.透射电镜下观察肝细胞的超微结构及其损伤改变。5.应用DHE荧光探针评估肝细胞的氧化应激水平,即ROS(活性氧自由基簇),IPP细胞图像分析管理系统进行定量。6.免疫组织化学染色观察肝细胞内炎症因子(IL-1β、IL-6、TNFα)的含量,IPP细胞图像分析管理系统进行定量分析。7.Real-time PCR 检测 NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNFα 相关基因 mRNA 的表达水平。8.Western blotting 检测 NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNFα 蛋白的表达,结果以β-actin为内参照,用ImageJ图像分析软件进行条带灰度分析,测定各目的蛋白条带的灰度值,用目的蛋白/内参灰度值来表示目的蛋白的相对表达量。9.酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清LPL含量,Peroxidase Anti-peroxidase Method(PAP酶法)检测血清血脂水平(TG、TC),进行各组之间对比分析。结果1.与常氧对照组比较,低氧模型组大鼠体重明显增长(P0.05);与模型对照组比较,治疗组体重增长正常(P0.05),肥胖趋势明显,治疗后缓解。2.与常氧对照组比较,低氧模型组大鼠肝脏HE染色,细胞的形态学出现脂质积聚、脂肪空泡形成,导致肝细胞脂肪变性,脂质代谢异常。与模型对照组比较,治疗组则明显好转,脂质代谢改善。3.红色颗粒为脂质样物。与常氧对照组比较,低氧模型组大鼠肝脏脂质油红“O”染色,细胞脂质明显染红,与模型对照组比较,治疗组脂质染红减轻。IOD/Area差异均有统计学意义(P0.05)。4.与常氧对照组比较,低氧模型组大鼠肝脏透射电镜超微结构显示,细胞内见脂滴积聚、大量自噬小体、溶酶体的出现,粗面内质网糖原的灶性聚积及毛细胆管微绒毛稀疏。与模型对照组比较,治疗组则很少见此征象,脂滴减少,超微结构损伤减轻。5.红色荧光为阳性表达。与常氧对照组比较,低氧模型组大鼠肝脏氧化应激ROS表达明显;与模型对照组比较,治疗组ROS表达减少。IOD/Area差异均有统计学意义(P0.05)。6.其作为阳性的标志为黄色颗粒。与常氧对照组比较,低氧模型组大鼠肝脏免疫组织化学检测IL-1β,IL-6和TNFα,炎症水平明显上调(P0.05),蛋白表达显著;与模型对照组比较,治疗组炎症水平下调(P0.05),蛋白表达弱。IOD/Area值差异均有统计学意义(P0.05)。7.与常氧对照组比较,低氧模型组大鼠肝脏NF-κBp65、IL-1β、IL-6、TNFα基因mRNA的表达显著,与模型对照组比较,治疗组表达弱。基因表达量差异均有统计学意义(P0.05)。8.与常氧对照组比较,低氧模型组肝脏NF-κBp65、IL-1β、IL-6、TNFαα蛋白相对表达显著,与模型对照组比较,治疗组表达弱。蛋白的相对表达量差异均有统计学意义(P0.05)。9.与常氧对照组比较,低氧模型组肝脏血清LPL下调和血脂TG、TC上调(P0.05);与模型对照组比较,治疗组相反,LPL下降及血脂上升(P0.05),比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论1.CIH诱导的大鼠肝组织出现氧化应激产生大量ROS。2.CIH激活ROS/NF-κB信号通路并且调控炎症因子的表达。3.CIH下调血清LPL、上调TG和TC水平。4.CIH可引起大鼠肝细胞脂质聚集和损伤及异常体重增加。5.CIH诱导的大鼠肝组织损害可能与ROS/NF-KB信号通路有关。6.NAC可改善慢性间歇性低氧大鼠模型下的脂质代谢障碍和体重异常增加,其机制可能与抑制ROS/NF-KB信号相关。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R766
【部分图文】：

图２．?Ａ为气路控制流程模拟图。Ｂ为气体来源和输入输出实物图。①白箭头为空气压缩机，??黑箭头为氮气嫌。②主机和氧船的连接．其中白箭头为空气输入，黑箭头为氮气输入，红??箭头为混合气体输出进入动物舱体。??２４??

图３？输入空气、氮气周期时序模拟图

图３组大鼠肝细胞形态学改变：常氧对照组（ＣＯＮ），ＣＩＨ棋型组（ＣＩＨ），ＣＩＨ＋０．９％??ＮａＣｌ?模型对照组（ＣＩＨ＋ＮＳ），ＣＩＨ＋?Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ?治疗组（ＣＩＨ＋ＮＡＣ）。（Ａ）?ＨＥ?染??色和袖红“０’，染色，ｘ４００，ｓｃａｌｅｂａｒ：２〇ｎｍＢ?透射电镜（ＴＥＭ）?，?ｓｃａｌｅｂａｒ：２ｎｍ?（插图为较??低放大倍数，ｓｃａｌｅ?ｂａｒ：５ｆｉｍ）。图片中字母符号：ＬＤ－脂滴，ＡＰ－自噬小体，ＬＰ名薄体，??ＢＣ－毛细胆管｜?ＭＩ－线粒体，ＲＥＲ－粗面内质网，ＧＬ－糖原。（Ｂ）?ＩＯＤ／Ａｒｅａ?（ｄｅｎｓｉｔｙ?ｍｅａｎ）??为有效统计区域面积内的累计光密度平均值。＊戶＜０．０５，?＃Ｐ＞０．０５。??４９??
【参考文献】

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1 慕超;王岩;李延忠;;重度阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者血清缺氧诱导因子-1α和胰岛素样生长因子-1及脑源性神经营养因子与认知功能的关系[J];临床耳鼻咽喉头颈外科杂志;2014年12期

本文编号：2872689