CrkⅡ在喉鳞状细胞癌中的表达及其作用的研究

发布时间：2020-11-04 20:53

　　 目的:研究接头蛋白Crk II在喉鳞状细胞癌中的表达,探究Crk II蛋白与喉鳞状细胞癌临床病理特征的关系,并采用RNA干扰法敲低Crk II的表达,研究Crk II的表达水平下调后对喉癌Hep-2细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:采用免疫组织化学法(SP法)对54例喉癌手术切除标本进行检测,分析Crk II蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达与喉癌患者的临床分期、病理分级、有无淋巴转移以及年龄的关系;根据Gen Bank数据库中人类Crk II基因编码序列(序列号:NM016823.3),使用Invitrogen公司在线设计软件设计针对CrkⅡ基因的si RNA干扰序列,并设计无关序列作为阴性对照。以脂质体转染法将构建好的Crk II RNA干扰质粒及阴性对照质粒分别转染至Hep2细胞中,24h后开始于倒置荧光显微镜下观察转染效率并拍照,本实验将分为三组:实验组(转染Crk II RNA干扰质粒组)、阴性对照组(转染阴性对照质粒)和空白对照组(未转染质粒组)。转染成功后,利用real-time PCR检测Crk II在m RNA水平表达下调的情况,Western blot检测Crk II在蛋白质水平表达下调的情况,分别通过MMT实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测细胞的增殖能力、细胞的迁移能力、细胞的侵袭能力。结果:1.Crk II在22例喉鳞状细胞癌癌旁组织中不表达或少量表达,其阳性表达率为9.1%;在54例喉鳞状细胞癌组织中有37例明显高表达,Crk II的阳性表达率为68.5%。喉鳞状细胞癌组织中Crk II的阳性表达率与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P0.05),且Crk II的阳性表达率在喉鳞状细胞癌的临床分期、病理分级及有无淋巴结转移方面差异有统计学意义(χ2=9.643,χ2=4.987,χ2=3.833,P值均0.05);2.成功构建Crk II RNA干扰质粒,并将其转染至Hep2细胞株,转染后可显著抑制喉癌细胞系Hep-2细胞内源性Crk II m RNA和蛋白表达水平(P0.01);3.MTT实验结果:转染后检测实验组Hep-2细胞在各时间点OD值均比空白对照与阴性对照组低(P0.01),且OD值随着时间的延长差别也逐渐增大,但阴性对照组与空白对照组的OD值相比较,差异无统计学意义(P0.05);4.细胞划痕实验:48h时实验组细胞迁移距离比空白对照组和阴性对照组显著降低(t=8.591、19.666,P0.01),且空白对照组与阴性对照组相比较,迁移距离无明显差异(t=1.403,P0.05);5.Transwell侵袭实验:结果显示阴性对照组和空白对照组穿过基质膜到达下室的平均细胞数差异无统计学意义(t=0.256,P0.05),实验组细胞穿过基质膜到达下室的平均细胞数较空白对照组和阴性对照组均明显减少(t=10.226、9.707,P0.01)。结论:1.Crk II蛋白可能通过促进癌细胞的侵袭与转移在喉癌的发展过程中发挥重要作用;2.成功构建Crk II RNA干扰质粒,能有效下调Crk II在Hep-2细胞中的表达;3.下调喉癌细胞系Hep-2细胞中Crk II的表达后细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显下降,提示Crk II蛋白有望成为喉癌治疗的新靶点。
【学位单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.65
【部分图文】：

贵州医科大学 2018 届科学学位硕士研究生学位论文表 1-1 针对 CrkII 基因设计 siRNA 序列及无关序列Tab. 1-1 siRNA sequence and unrelated Sequence of CrkI靶序列 GGATCAACAGAATCCCGATGA GTTCTCCGAACGTGTCACGT体与构建U6/RFP/Neo 表达载体（图 1-1），该载体中带有 RFP（荧光蛋白）表达基因及 Neomycin 抗性筛选标记基因筛选稳定表达的单克隆细胞系，将设计好的 siRNl 酶切位点。CrkII RNA 干扰质粒交给上海吉玛制药

CCTTGTAGATGAAGCAGCCGTCCTGCAGGGAGGAGTCCTGGGTCACGCCACGCCGCCGTCCTCGAAGTTCATCACGCGCTCCCACTTGAAGCCGGGAAGGACAGCTTCTTGTAGTCGGGATGTCGGCGGGTGCTTCACGCCTTGAGCCGTACTGACTGGGGGGACAGGATGTCC.AGGCGAAGGCGCCGCCCTTGG CrkII RNA 干扰质粒的转染及转染效率.1 CrkII RNA 干扰质粒的转染将 CrkII RNA 干扰质粒转染至 Hep-2 细胞中，分别于转染后 24 h、48h、倒置荧光显微镜下观察红色荧光蛋白(RFP)的表达情况，在 72h 时可见p-2 细胞表达红色荧光，因此表明，CrkII RNA 干扰质粒可以有效转染至 H胞并稳定表达。如图 2-2 所示。

贵州医科大学 2018 届科学学位硕士研究生学位论文2.4.2 实时荧光定量 PCR 检测 CrkII RNA 干扰质粒在 mRNA 水平的干扰效率（1）扩增曲线和溶解曲线从扩增曲线看呈 S 形，平行空间误差较小，从溶解曲线看没有出现非特异性扩增，特异性可，结果可信。如图 2-3 和 2-4
【参考文献】

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1 李晓明;;喉癌外科手术及综合治疗专家共识[J];中华耳鼻咽喉头颈外科杂志;2014年08期

2 阴传敏;姚珍薇;令狐华;;信号接头蛋白crk在宫颈癌Caski细胞恶性潜能中的作用[J];肿瘤;2009年02期

3 阴传敏;姚珍薇;令狐华;;信号接头蛋白Crk在子宫颈癌组织中的表达和意义[J];重庆医科大学学报;2008年07期

本文编号：2870595