鼻咽癌细胞与淋巴管内皮细胞交互作用的差异分子验证

发布时间：2020-11-18 21:45

　　 背景:鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤之一,早期患者容易发生淋巴结转移,肿瘤微环境中细胞与细胞的交互作用可能对淋巴结转移起到了极其重要的作用。本课题组在前期研究中发现,鼻咽癌高淋巴结转移细胞株5-8F条件培养基(conditioned medium,CM)明显促进淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cell,LEC)的增殖,而LEC细胞条件培养基促使5-8F细胞的侵袭迁移能力增强;通过两种细胞的共培养发现可以明显促进细胞的运动和迁移,特别是直接接触培养尤为明显。接着,我们通过分选型流式细胞仪将共培养后的两种细胞分选出来分别与单独培养的同种细胞进行RNA-Seq及蛋白抗体芯片检测,并通过生物信息学分析筛选了潜在的作用通路。根据分析结果,发现差异分子主要富集于TGF-β信号通路以及细胞粘附、细胞趋化因子、血管生成因子等方面,并且共培养后细胞内的miR-17-92等部分miRNA存在表达差异。目的:反复验证体外共培养条件下LEC与5-8F细胞的交互作用,同时验证共培养后的差异表达分子,并综合分析其在鼻咽癌转移中的可能作用。方法:分别制备LEC与5-8F细胞培养24h后的条件培养基,将两种细胞进行条件培养基共培养,然后通过Realtime-PCR和Western Blot方法检测细胞中TGF-β及部分转移相关分子的表达情况;接着采用条件培养基共培养和transwell共培养两种方式进行LEC和5-8F的共培养,分别检测细胞以及上清液中miR-17-92基因簇成员的表达情况;最后对miR-17-92进行靶基因预测及生物信息学分析。结果:1.采用Realtime-PCR和Western Blot方法检测CM共培养前后LEC和5-8F细胞中基因和蛋白的表达情况,发现共培养后,LEC细胞中TGF-β以及转移相关分子(CTGF、Fractalkine、DCN、IGF-2R、MIF)表达均降低了;而在5-8F细胞中表达均升高了。2.从转录水平和蛋白水平检测E-cadherin的表达情况,发现CM共培养后LEC和5-8F细胞中表达均降低了,而β-catenin、MMP-9和Vimentin在转录水平的表达均升高了。3.CM共培养后,5-8F和LEC细胞以及上清液中的大多数miR-17-92基因簇成员的表达升高了。4.在transwell共培养中,当5-8F接种于下室,LEC接种于上室时,共培养后这两种细胞以及上清液中miR-17-92基因簇成员的表达均明显升高了;而当LEC接种于下室,5-8F接种于上室时,共培养后这两种细胞中miR-17-92基因簇成员的表达也均明显升高,但共培养后的上清液中miR-17-92基因簇的大多数成员表达降低了。5.GO分析发现,miR-17-92的预测靶基因主要参与了细胞过程、生物调节、代谢过程、应激反应、发展过程、细胞成分组织或生物起源等生物过程;KEGG Pathway分析发现,靶基因显著富集于内吞作用通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路、癌症中的蛋白聚糖通路、非小细胞肺癌通路、PI3K-Akt信号通路、黏附连接、凋亡、TGF-beta信号通路等。结论:1.条件培养基共培养后,5-8F细胞中的TGF-β通路部分关键基因上调,可能是其迁移能力增强的原因之一,而共培养后LEC细胞中的TGF-β通路部分关键基因表达下调,可能促进了LEC的增殖。2.鼻咽癌细胞5-8F可刺激LEC细胞分泌miR-17-92,而miR-17-92基因簇的上调可能与淋巴管内皮细胞增生相关。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.63
【部分图文】：

共培养后细胞中基因表达情况

2.2 条件培养基共培养前后细胞中的蛋白表达检测利用 Western Blot 方法检测条件培养基共培养前后细胞中的蛋白表达水平，结果如图1-2所示，发现共培养后，与对照组相比LEC细胞中TGF-β1、TGF-β2（p<0.05）、CTGF、Fractalkine（p<0.05）、DCN、IGF-2R（p<0.05）、MIF、E-cadherin 表达均降低了；在 5-8F 细胞中 TGF-β1（p<0.05）、TGF-β2、CTGF、Fractalkine（p<0.05）、DCN、IGF-2R（p<0.05）、MIF 表达均升高了，而 E-cadherin 虽然表达有下降的趋势，但差异没有统计学意义。WB结果均与 Realtime-PCR 结果 致。图 1-2 共培养后细胞中蛋白表达情况Figure 1-2 The expression of protein in cells after co-cultured by western blot.3 讨论鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤之 ，尤其是广东和广西等地发病率很高。大多数患者初诊时就发现有淋巴结转移，NPC 淋巴结转移不但影响了治疗计划和临床分期，同时也影响了患者的疗效和预后。NPC 淋巴结转移的分子机制目前还不是十分清楚，因此深入探讨 NPC 淋巴结转移规律

49图 2-4 transwell 共培养后 LEC 细胞中 miRNA 表达情况Figure 2-4 Expression of miRNA in LEC cells after transwell co-culture. LEC_low, LEC is planted in thelower chamber; LEC_up, LEC is planted in the upper chamber.
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本文编号：2889239