Decorin抑制脉络膜/视网膜新生血管的实验研究

发布时间：2021-01-25 23:30

　　目的：脉络膜、视网膜新生血管形成是眼底病患者视力损害的主要原因。缺氧导致的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌增高，促使血管内皮细胞增殖、迁移是眼底新生血管形成的共同病理特点，但目前尚缺乏安全有效的治疗方法。如何抑制低氧条件下VEGF的过量分泌是治疗脉络膜视网膜新生血管的关键。Decorin是一种小分子富含亮氨酸的蛋白聚糖，对细胞表面多种受体酪氨酸激酶具有拮抗作用，但能否调控眼底新生血管的形成尚不明确。本课题首先检测decorin对人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）低氧条件下分泌VEGF的影响及可能机制；然后构建携载decorin编码基因的慢病毒载体转染ARPE-19细胞，并与脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）共培养，检测转染的ARPE-19细胞低氧条件下对RF/6A细胞血管生成能力的影响；最后，构建携载decorin编码基因的自身互补型腺相关病毒载体，建立小鼠氧诱导视网膜病变模型，在体观察decorin对视网膜新生血管的抑制作用。方法：（1）体外实验部分：首先应用CCK-8和ELISA法明确decorin抑制A... 

【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：101 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
图题索引
缩略词
目录
绪论
第一章 Decorin 抑制视网膜色素上皮细胞低氧条件下 VEGF 分泌的研究
    1.1 前言
    1.2 材料与方法
        1.2.1 实验材料
        1.2.2 ARPE-19 细胞培养和低氧模型
        1.2.3 CCK-8 检测不同浓度 decorin 对细胞活力的影响
        1.2.4 ELISA 法检测 decorin 抑制 ARPE-19 细胞低氧条件下分泌 VEGF 的作用
        1.2.5 荧光定量 PCR 检测 decorin 对 ARPE-19 细胞低氧条件下 Met、Rac1、HIF-1α和VEGF mRNA表达的影响
        1.2.6 Western blot 检测 decorin 对 ARPE-19 细胞低氧条件下 Met、Rac1 和 HIF-1α蛋白表达的影响
        1.2.7 敲除 ARPE-19 细胞的 Met 基因及验证
        1.2.8 ARPE-19 细胞转染 Met siRNA 后在低氧条件下 Rac1、HIF-1α和 VEGF 的表达变化
        1.2.9 统计学分析
    1.3 结果
        1.3.1 不同浓度 decorin 对 ARPE-19 细胞活力的影响
        1.3.2 不同浓度 decorin 对 ARPE-19 细胞低氧条件下过量分泌 VEGF 的影响
        1.3.3 Decorin 抑制 ARPE-19 细胞低氧条件下 Met、Rac1、HIF-1α和 VEGF 的高表达
        1.3.4 Met siRNA 抑制 ARPE-19 细胞低氧条件下 Met、Rac1、HIF-1α和 VEGF 的表达
    1.4 讨论
第二章 视网膜色素上皮细胞 decorin 过表达抑制脉络膜新生血管形成的体外研究
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 构建含 decorin 开框区序列的慢病毒质粒 pGMLV-PA5
        2.2.3 慢病毒的包装和浓缩
        2.2.4 携 decorin 基因的慢病毒载体转染 ARPE-19 细胞的验证
        2.2.5 ARPE-19 细胞 decorin 过表达对低氧环境下 VEGF 分泌的影响
        2.2.6 ARPE-19 细胞与 RF/6A 细胞共培养
        2.2.7 统计学分析
    2.3 结果
        2.3.1 成功构建含 decorin 开框区的慢病毒质粒 pGMLV-PA5
        2.3.2 ARPE-19 细胞转染携 decorin 基因慢病毒载体的验证
        2.3.3 低氧环境下 ARPE-19 细胞 decorin 过表达对 VEGF 分泌的影响
        2.3.4 低氧条件下 ARPE-19 细胞过表达 decorin 抑制共培养 RF/6A 细胞的血管生成能力
    2.4 讨论
第三章 自身互补型腺相关病毒携载 decorin 抑制 C57 小鼠视网膜新生血管的实验研究
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 原代培养大鼠神经胶质细胞
        3.2.3 构建含 decorin 开框区序列的自身互补型腺相关病毒质粒scAAV-CMV-decorin
        3.2.4 自身互补型腺相关病毒质粒转染大鼠神经胶质细胞的验证及病毒包装
        3.2.5 小鼠氧诱导视网膜病变模型建立及玻璃体腔注射
        3.2.6 视网膜铺片染色
        3.2.7 荧光定量 PCR 检测
        3.2.8 Western blot 检测
        3.2.9 ELISA 检测
        3.2.10 统计学分析
    3.3 结果
        3.3.1 大鼠神经胶质细胞的培养和鉴定
        3.3.2 scAAV-CMV-Decorin 病毒质粒的构建及验证
        3.3.3 scAAV-CMV-decorin 质粒转染大鼠神经胶质细胞的验证
        3.3.4 玻璃体腔注射 scAAV-CMV-decorin 病毒抑制 OIR 小鼠视网膜新生血管的生成
        3.3.5 玻璃体腔注射 scAAV-CMV-decorin 病毒抑制 OIR 小鼠视网膜 HIF-1α和 VEGF的表达
    3.4 讨论
结论
参考文献
致谢
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本文编号：3000076