Neuroserpin对视网膜缺血再灌注损伤的保护功能及其作用机制的研究

发布时间：2017-09-07 07:19

  本文关键词：Neuroserpin对视网膜缺血再灌注损伤的保护功能及其作用机制的研究

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【摘要】：目的：Neuroserpin作为一种功能性的丝氨酸蛋白酶抑制剂,在中枢发挥重要的神经保护功能,并且其神经保护功能是否跟其组织型纤溶酶原激活剂的抑制活性相关颇受争议。本课题旨在探讨NSP对视网膜缺血再灌注损伤的保护功能及其保护功能是否依赖于对组织型纤溶酶原激活剂的抑制。方法：本课题主要使用了野生鼠(WT)和tPA基因敲除鼠(tPA-/-)。先采用微量注射器对成年鼠玻璃体腔注射lul的NSP或者时等体积胎牛血清(BSA)对照液,然后采用前房灌注系统急性升高眼内压至120mmhg并持续60mins,建立视网膜缺血再灌注损伤模型。在建模之后1天、7天采用ERG技术对缺血再灌注损伤后视网膜功能进行评估,采用TUNEL染色对视网膜结构进行评估,同时采用蛋白印记(western blot)技术对视网膜caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9、 cleaved caspase-9、caspase-8、cleaved caspase-8、PARP及cleaved PARP进行测量。最后,采用免疫荧光技术和western blot技术探究NSP在视网膜缺血灌注注损伤中的表达及其表达的分布。结果：通过实验发现,视网膜缺血再灌注损伤导致严重的视网膜功能损害和视网膜神经元凋亡,而预先玻璃体腔预注射NSP显著保护视网膜损伤,而且NSP的视网膜保护功能在WT和tPA-/-鼠中相似。同时实验发现在缺血损伤的视网膜中,caspase-3, caspase-9、PARP显著激活,而NSP能抑制其激活,NSP对这些蛋白的抑制在WT和tPA-/-鼠中也是相似的。NSP在正常视网膜中基本上不表达,而在视网膜缺血再灌注损伤后显著表达并主要分布于视网膜神经节细胞。结论：因此我们提出,NSP可以保护视网膜缺血再灌注损伤,这种保护功能不依赖于对组织型纤溶酶原激活剂的抑制,而且可能是通过抑制caspase-3激活来发挥视网膜保护功能。
【关键词】：Neuroserpin 视网膜缺血再灌注损伤 细胞凋亡 组织型纤溶酶原激活剂
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R774.1
【目录】：

• 英文缩略词表3-7
• 中文摘要7-8
• Abstract8-9
• 前言9-19
• 参考文献12-19
• 第一部分 Neuroserpin在视网膜组织中的表达与分布19-27
• 目的19
• 材料19-20
• 1. 实验动物19
• 2. 主要试剂19
• 3. 主要设备和仪器19-20
• 4. 药物和溶液配制20
• 方法20-24
• 1. 视网膜缺血再灌注损伤模型的制备20-21
• 2. 视网膜组织Neuroserpin的表达与分布21-24
• 2.1 视网膜组织样本的准备21
• 2.2 免疫荧光技术对Neuroserpin进行定位分析21-22
• 2.3 蛋白印记技术对Neuroserpin进行定量分析22-24
• 结果24-26
• 1. 生理及病理情况下Neuroserpin在视网膜组织中的表达及分布24-26
• 2. 不同的灌注压及灌注时间,均可诱导neuroserpin的表达26
• 小结26-27
• 第二部分 Neuroserpin玻璃体腔注射对视网膜缺血再灌注损伤的保护27-40
• 目的27
• 材料27-29
• 1. 实验动物27
• 2. 主要试剂27
• 3. 主要设备和仪器27-28
• 4. 药物和溶液配制28-29
• 方法29-33
• 1. 玻璃体腔注射29
• 1.1 注射前准备29
• 1.2 玻璃体腔给药29
• 2. 视网膜缺血再灌注模型制备29
• 3. 暗适应ERG的测量29-30
• 3.1 视网膜ERG记录时间点29
• 3.2 测量前准备29-30
• 3.3 ERG记录30
• 4. 小鼠视网膜神经元凋亡的检测30-31
• 4.1 视网膜样本收集30
• 4.3 准备冰冻切片30
• 4.4 TUNEL试剂盒进行凋亡染色30-31
• 4.5 计数方法31
• 5. 视网膜缺血再灌注损伤后caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、cleavedPRAP、caspase-9、cleaved caspase-9、caspase-8、cleaved caspase-8蛋白表达水平的分析(免疫印迹western blot)31-33
• 5.1 视网膜蛋白样本的准备31
• 5.2 配制SDS-PAGE浓缩胶与分离胶31
• 5.3 上样31
• 5.4 SDS-PAGE电泳31-32
• 5.5 转膜32
• 5.6 蛋白质显像32
• 5.7 免疫检测32
• 5.8 化学发光检测32-33
• 5.9 结果分析33
• 6. 统计分析33
• 结果33-39
• 1. 在野生型C57小鼠视网膜缺血再灌注损伤中,Neuroserpin玻璃体预干预促进视网膜功能的恢复33-35
• 2. Neuroserpin玻璃体给药保护视网膜缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡35-37
• 3. Neuroserpin抑制caspase-3和PARP的激活来发挥抗凋亡功能37-38
• 4. Neuroserpin通过抑制caspase-9通路来抑制caspase-3的激活38-39
• 小结39-40
• 第三部分 Neuroserpin对视网膜缺血再灌注损伤是否依赖于对组织型纤溶酶原激活剂的抑制活性40-46
• 目的40
• 材料40
• 1. 实验动物40
• 2. 主要试剂：同第二部分主要试剂40
• 3. 主要设备和仪器：同第二部分主要试剂40
• 方法40-41
• 1. tPA基因敲除鼠(tPA~(-/-))验证40
• 1.1 取视网膜40
• 1.2 采用蛋白印记技术验证tPA~(-/-)鼠视网膜组织中不表达tPA蛋白40
• 2. 玻璃体腔注射40
• 3. 视网膜缺血再灌注模型制备40-41
• 4. 暗适应ERG的测量41
• 5. tPA基因敲除(tPA~(-/-))鼠视网膜缺血再灌注损伤后caspase-3、cleavedcaspase-3、PARP、cleaved PRAP蛋白表达水平的分析(免疫印迹western blot)：41
• 6. 统计学分析41
• 结果41-45
• 1. 在tPA基因敲除鼠(tPA~(-/-))中Neuroserpin玻璃体给药促进视网膜缺血再灌注损伤功能的恢复41-43
• 2. 在tPA基因敲除鼠(tPA~(-/-))中,Neuroserpin玻璃体给药保护视网膜缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡43-45
• 3. 在tPA基因敲除鼠(tPA~(-/-)),Neuroserpin抑制caspase-3和PARP的激活来发挥抗凋亡功能45
• 小结45-46
• 讨论46-48
• 全文总结及展望48
• 参考文献48-52
• 综述52-62
• 参考文献56-62
• 致谢62-63

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 李艳菊;谭淑慧;夏春凤;张镛;杜怡峰;马国诏;;NF-κB对Aβ_(1-42)诱导神经元K_(ATP)亚基Kir6.2/SUR1表达的影响[J];山东大学学报(医学版);2013年10期

2 王U喅，

本文编号：808160