酵母双杂交法筛选鼻咽癌细胞中Flot2相互作用蛋白

发布时间：2017-09-12 14:11

  本文关键词：酵母双杂交法筛选鼻咽癌细胞中Flot2相互作用蛋白

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【摘要】：鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)是一种起源于鼻咽部的恶性肿瘤,在我国南方省份、东南亚国家和非洲部分地区高发。其发病可能是膳食结构、病毒感染、遗传突变和环境因素等多个因素共同作用导致的。临床上鼻咽癌具有早期颈部淋巴结转移且易发生远处转移的特点。研究表明大部分患者以颈部淋巴结肿大为最初表现,相当部分患者会发生远处转移。而发生了远处转移的患者治疗失败和复发的几率则大大增加。 浮舰蛋白Flotillins家族最早是在金鱼视网膜神经节细胞受损后轴突的再生过程中被发现的一类蛋白,是一种脂筏标志性蛋白,主要定位于细胞膜内表面,在多种类型细胞中广泛存在。在细胞膜上,其作为脚架,为蛋白间相互作用提供平台,也参与信号转导、神经再生、内吞作用、淋巴细胞活化等。 前期工作中,我们利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),以来源于同一鼻咽癌细胞系SUNE-1的具有不同转移能力的两个亚株5-8F(高成瘤、高转移能力)和6-10B(成瘤、无转移能力)为材料,构建了两个亚细胞株间的消减cDNA文库,发现了与转移相关的数个差异表达的基因,然后选择Flotillin-2(Flot2)作为后续的研究对象。采用RNAi技术干扰Flot2后5-8F细胞的增殖、侵袭、转移能力均下降,G1期细胞比例上升,提示Flot2可能与鼻咽癌的转移正相关。 本研究在前期工作的基础上,通过构建5-8F细胞系的cDNA文库,采用酵母双杂交技术筛选出Flot2目互作用蛋白并进行鉴定。实验结果如下： 首先,我们以NCBI上的Flot2基因CDS序列为模板从5-8F细胞总RNA中扩增出了其ORF序列,然后我们将其体外连接到pGBKT7-BD载体上,构建了该基因的酵母诱饵表达载体(pGBKT7-Flot2)。同时,利用LD-PCR方法构建了5-8F细胞的cDNA文库并同源重组进pGADT7-AD载体中,构建了pGADT7-cDNA的文库质粒。将上述载体分别转化Y2HGold和Y187酵母菌,采用酵母双杂交的方法筛选出阳性克隆,然后抽提质粒测序分析,将可能的相互作用蛋白的质粒与诱饵质粒再次共转化Y2HGold菌鉴定。 实验结果显示以Flot2为诱饵蛋白筛选5-8F细胞文库后获得阳性克隆36个,经过测序与序列比对,发现有5个蛋白(PLCD3、 PCD7、PTPRJ、PCBP1和copine Ⅱ)有可能与Flot2有相互作用,然后通过共转化的方法鉴定了是否发生相互作用,回交结果显示其中4个蛋白(PLCD3、PCDH7、PTPRJ、PCBP1)确定与Flot2有相互作用。 本实验在前期工作的基础上,建立了5-8F细胞系的酵母双杂交文库和稳定表达FLOT2的Y2HGold酵母菌株；筛选出了与Flot2蛋白相互作用的4个候选蛋白并进行了初步的鉴定,为进一步研究Flot2的功能及其在鼻咽癌的侵袭、转移过程中的作用提供了依据。
【关键词】：鼻咽癌 flotillin-2(Flot2) 转移 酵母双杂交
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 目录9-10
• ~.写词简表10-11
• 前言11-14
• 技术路线图14-16
• 第一部分 材料与方法16-31
• 1.1 材料16-19
• 1.2 方法19-31
• 第二部分 实验结果31-44
• 2.1 pGBKT7-Flot2诱饵载体的构建及自激活和毒性检测31-35
• 2.2 5-8F细胞系酵母双杂交文库构建35-36
• 2.3 酵母双杂交筛选Flot2相互作用蛋白36-42
• 2.4 FLOT2候选相互作用蛋白的初步鉴定42-44
• 第三章 讨论44-48
• 3.1 构建高质量的酵母双杂交文库44
• 3.2 构建PGBKT7-FLOT2诱饵载体44-45
• 3.3 筛选FLOT2相互作用蛋白并初步鉴定45-48
• 结论48-49
• 参考文献49-56
• 综述56-63
• 参考文献59-63
• 攻读学位期间已发表和待发表论文63-64
• 致谢64-65
• 简历65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 姚开泰;鼻咽癌研究的回顾与展望（纪念湖南医科大学80周年校庆）[J];湖南医科大学学报;1995年02期

2 段志强;王郁杨;朱艳梅;开妍;胡顺林;王晓泉;刘秀梵;;鸡胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定[J];扬州大学学报(农业与生命科学版);2011年02期

3 张锋,张锦明;Clinical hereditary characteristics in nasopharyngeal carcinoma through Ye-Liang's family cluster[J];Chinese Medical Journal;1999年02期

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本文编号：837679