鼻咽癌放疗抗拒细胞生物学特性研究

发布时间：2017-09-19 19:19

  本文关键词：鼻咽癌放疗抗拒细胞生物学特性研究

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【摘要】：目的：研究鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs放疗抗拒性、紫杉醇敏感性及侵袭转移能力,并在课题组前期研究基础上通过体外实验对上皮-间质转化(EMT)与鼻咽癌放疗抗拒细胞生物学特性的相关性进行初步探讨。 方法：一、以鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs及其亲本细胞CNE-2为研究对象,检测鼻咽癌放疗抗拒细胞生物学特性：(1)CCK-8法、克隆形成实验及流式细胞术检测鼻咽癌细胞放疗抗拒性；(2)CCK-8细胞毒性实验检测鼻咽癌细胞对紫杉醇敏感性；(3)划痕愈合实验及Transwell小室侵袭实验检测鼻咽癌细胞体外迁移及侵袭能力。 二、显微镜观察鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs形态学改变；Western Blot检测鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs及亲本细胞CNE-2上皮-间质转化分子标志物表达情况,及鼻咽癌放疗前及放疗后残留组织标本EMT分子标志物表达水平。 结果：一、鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs较其亲本细胞具有更强的放疗抗拒性：CNE-2-Rs细胞在4Gy、6Gy和8Gy不同放射剂量下均表现出更高的生存率(P均0.01)；给予同一放射剂量,CNE-2-Rs细胞在第2天便出现更高的生存率(P均0.05),且差异随天数逐渐增大；克隆形成实验显示CNE-2-Rs细胞较亲本细胞形成的克隆更大、数目更多；流式细胞术结果表明,给予4Gy放射线照射,72小时后CNE-2-Rs细胞凋亡率明显低于CNE-2细胞(22.43±0.18%vs38.07±0.66%,P0.001)；而CNE-2-Rs与亲本细胞在未照射时细胞周期分布无差异,但给予4Gy放射线照射,72h后CNE-2-Rs细胞较亲本细胞处于S期(28.78±1.72vs21.42±1.09,P0.05)和G2期(37.34+3.68vs24.66±1.68,P0.05)细胞比例增多,处于G1期细胞减少(33.88±5.38vs53.91±1.6,P0.05)。 二、鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs获得了更强的紫杉醇耐药性：CNE-2-Rs和CNE-2细胞的紫杉醇药物IC50分别为8.53±3.61×10-1及6.28±2.37x10-2(nM)(P0.001),CNE-2-Rs细胞的紫杉醇耐药指数为13.57±1.58。 三、鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs获得了更强的体外迁移及侵袭能力：划痕愈合实验结果显示,放疗抗拒CNE-2-Rs细胞划痕愈合能力明显增强；Transwell小室侵袭实验显示与亲本细胞CNE-2相比,CNE-2-Rs细胞穿过Transwell小室的细胞数更多(86±6vs26±8)(P0.01)。 四、鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs及放疗后残留组织发生EMT改变：(1)放射线照射后CNE-2细胞失去了原本多边形紧密相连的上皮细胞形态,细胞变长并伴有伪足形成,细胞连接疏松,呈现成纤维细胞样形态。提示与CNE-2相比,CNE-2-Rs细胞发生了典型的EMT形态学改变。(2)与CNE-2细胞相比,CNE-2-Rs细胞上皮细胞标志物E-cadherin明显下调,而间质细胞标志物Vimentin明显上调。(3)与放疗前的组织标本相比,放疗后鼻咽癌残留组织中上皮细胞标志物E-cadherin的表达显著下调,而相反间质细胞标志物Vimentin的表达则显著升高。 结论：鼻咽癌放疗抗拒CNE-2-Rs细胞较其亲本细胞获得了更强的放疗抗拒、紫杉醇耐药及体外运动侵袭能力。放射线照射筛选放疗抗拒细胞,使得最终获得的放疗抗拒CNE-2-Rs细胞发生了典型的EMT形态学及分子标志物改变。该研究结果提示EMT改变可能与鼻咽癌细胞放疗抗拒、侵袭转移及紫杉醇耐药三种恶性生物学行为进展密切相关,为今后从同一个视角研究鼻咽癌上述三种恶性生物学行为奠定了实验基础。
【关键词】：鼻咽癌 放疗抗拒 紫杉醇耐药 侵袭 转移 上皮-间质转化
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-13
• 缩略词表13-14
• 1 前言14-16
• 2 材料与方法16-23
• 2.1 细胞株及鼻咽癌组织16
• 2.2 主要试剂及耗材16-17
• 2.3 主要实验仪器17-18
• 2.4 实验方法18-23
• 2.4.1 细胞培养及传代18
• 2.4.2 细胞放疗方法18
• 2.4.3 CCK-8法18-19
• 2.4.4 克隆形成实验19
• 2.4.5 流式细胞术19-20
• 2.4.6 划痕愈合实验20
• 2.4.7 Transwell小室侵袭实验20
• 2.4.8 鼻咽癌细胞形态学观察20-21
• 2.4.9 细胞/组织总蛋白提取21
• 2.4.10 细胞(组织)总蛋白浓度测定21
• 2.4.11 SDS-PAGE电泳及蛋白质印迹法(Western Blot)21-22
• 2.4.12 统计学方法22-23
• 3 结果23-25
• 3.1 放疗抗拒CNE-2-Rs细胞及其亲本细胞放疗差异性检测23
• 3.2 放疗抗拒CNE-2-Rs细胞及其亲本细胞紫杉醇敏感性检测23
• 3.3 放疗抗拒CNE-2-Rs细胞及其亲本细胞体外迁移及侵袭能力比较23-24
• 3.4 放疗抗拒CNE-2-Rs细胞发生EMT形态学改变24
• 3.5 放疗抗拒CNE-2-Rs细胞发生EMT经典分子标志物改变24
• 3.6 鼻咽癌放疗抗拒标本EMT分子标志物的差异表达24-25
• 4 讨论25-28
• 5 结论28-29
• 附图29-33
• 参考文献33-40
• 综述40-54
• 参考文献47-54
• 攻读学位期间主要研究成果目录54-55
• 致谢55-56

【共引文献】

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本文编号：883445