UBA52与Hsf4b的相互作用及调控

发布时间：2017-09-20 04:02

  本文关键词：UBA52与Hsf4b的相互作用及调控

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【摘要】：背景 研究发现，，Hsf4基因突变时，会引发新生儿先天性白内障，在动物实验中，敲除小鼠Hsf4基因，导致新生小鼠晶状体发育障碍，因此hsf4基因在新生儿晶状体发育过程中至关重要。 热休克转录因子家族有四个成员，Hsf4是其中之一，它有Hsf4a和Hsf4b两个亚型，而在眼晶状体中，只表达Hfs4b这一亚型。研究发现，Hsf4b的转录调控对晶状体早期发育至关重要，Hsf4b主要在新生晶状体的上皮细胞和次级纤维细胞内表达，它能激活小分子热休克蛋白Hsp25、γ和β晶状体蛋白的表达，调控晶状体上皮细胞增生和纤维细胞分化。已报道，在晶状体上皮细胞和纤维细胞分化过程中，泛素-蛋白酶体被激活，参与调控蛋白的降解和去除细胞内的膜性细胞器。我们运用酵母双杂交技术探索hsf4b相互作用的蛋白时，发现UBA52蛋白可与Hsf4b相互作用。 UBA52又称为泛素核糖体融合蛋白，是一个由N-端泛素分子和C-端核糖体L40组成的融合蛋白。在细胞内，蛋白酶可在UBA52蛋白72位的氨基酸处切割，转变为活化的泛素分子和L40核糖体分子。UBA52是细胞内泛素分子的一种存在形式，通过对蛋白的泛素化将蛋白转运到蛋白酶体降解或介导细胞内蛋白转运及蛋白之间的相互作用。本实验验证了UBA52与Hsf4b之间的相互作用和UBA52对Hsf4b转录活性的影响，至于二者之间调控的作用机理及产生的生物学效应，还有待进一步探究。 目的 利用体外实验过表达UBA52和Hsf4b，研究Hsf4b与UBA52的相互作用，并利用免疫荧光进行UBA52和Hsf4b的亚细胞定位。初步探究Hsf4b对泛素化过程的影响，验证UBA52是否对Hsf4b转录活性具有调控作用。 方法 通过Pull-down和免疫共沉淀技术验证UBA52与Hsf4b的相互作用，及与Hsf4b相互作用的结构域。用免疫荧光对UBA52与Hsf4b进行亚细胞定位。原核表达UBA52蛋白，利用Western Blot检测Hsf4b对泛素化修饰的影响及UBA52对Hsf4b转录活性的影响。 结果 （1）免疫共沉淀表明Hsf4b能够与泛素分子结合，且UBA52与Hsf4b（196-493）功能区域相结合，免疫荧光显示二者在细胞核内共定位。 （2）UBA52在体内可被剪切为泛素分子和核糖体蛋白L40，Western Blot表明在体内Hsf4b对UBA52的剪切没有影响。 （3）免疫共沉淀表明UBA52与Hsf4b虽然存在相互作用，但UBA52没有直接泛素化修饰Hsf4b。 （4）通过原核表达UBA52蛋白，把它和正常mlec细胞及能稳定过表达Hsf4b的mlec细胞裂解液在一定温度下孵育后，发现UBA52蛋白在体外也能被剪切，并且和过表达Hsf4b的mlec细胞裂解液孵育那组，Western Blot显示其泛素化明显增加，初步说明Hsf4b能促进泛素化修饰。 （5）Western Blot表明，当UBA52存在时，Hsf4b下游蛋白αB的表达量增加。 结论 UBA52与Hsf4b之间具有相互作用，但UBA52未直接泛素化修饰Hsf4b。Hsf4b对UBA52的剪切没有影响。Hsf4b能够促进泛素化修饰，而UBA52能够上调Hsf4b下游基因αB的表达。
【关键词】：UBA52 Hsf4b 相互作用 泛素化 转录调控
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R776.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 英文缩略词表11-13
• 前言13-15
• 1 材料与方法15-25
• 1.1 主要材料与试剂15-16
• 1.1.1 细菌、细胞和质粒来源15
• 1.1.2 主要试剂15
• 1.1.3 主要抗体15
• 1.1.4 主要仪器设备15-16
• 1.2 主要试剂配制16-21
• 1.2.1 培养细胞所需配制的试剂16-17
• 1.2.2 培养细菌的溶液17
• 1.2.3 SDS-PAGE 溶液的配制17-20
• 1.2.4 免疫荧光实验试剂的配制20-21
• 1.3 主要方法21-25
• 1.3.1 提取质粒21
• 1.3.2 制备感受态21
• 1.3.3 转化21
• 1.3.4 细胞培养的方法21-22
• 1.3.5 质粒转染细胞22
• 1.3.6 细胞的裂解及蛋白浓度的测定22
• 1.3.7 Western Blot 方法22-23
• 1.3.8 原核蛋白诱导表达23-24
• 1.3.9 免疫共沉淀24
• 1.3.10 免疫荧光24
• 1.3.11 GST pull-down24-25
• 2 结果25-33
• 2.1 CO-IP 验证 UBA52 与 HSF4B 相互作用25
• 2.2 UBA52 和 HSF4B 在细胞内共定位25-26
• 2.3 PULL-DOWN 验证 UBA52 与 HSF4B（196-493）功能区域结合26-27
• 2.4 HSF4B 过表达对 UBA52 在体内剪切没有影响27-28
• 2.5 CO-IP 表明 UBA52 与 HSF4B 是间接相互作用28-29
• 2.6 原核表达 UBA52 蛋白并验证与 HSF4B 在体外的相互作用29-30
• 2.7 UBA52 对 HSF4B 转录活性的影响30-33
• 3 讨论33-37
• 4 结论37-39
• 5 参考文献39-41
• 综述41-51
• 参考文献48-51
• 致谢51-53
• 在读期间发表的学术论文53-54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 徐存拴,熊蕾,卢龙斗;热休克蛋白(HSPs)在胚胎发育中作用的研究进展(英文)[J];Developmental & Reproductive Biology;2000年01期

2 刘世荣;何维;;SUMO化修饰:一种多功能的蛋白质翻译后修饰方式[J];医学分子生物学杂志;2006年03期

3 龚小卫;姜勇;;丝裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶(MK)研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2007年07期

4 龚小卫,姜勇;丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)生物学功能的结构基础[J];中国生物化学与分子生物学报;2003年01期

本文编号：885767