沉默信号调控因子1蛋白促进高糖环境下角膜上皮细胞损伤修复的实验研究

发布时间：2017-09-20 04:09

  本文关键词：沉默信号调控因子1蛋白促进高糖环境下角膜上皮细胞损伤修复的实验研究

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【摘要】：第一部分沉默信号调控因子1(Sirtl)在1型糖尿病模型小鼠角膜和三叉神经节中的表达 目的：探讨沉默信号调控因子(Sirt1)在1型糖尿病模型C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的角膜和三叉神经节中的表达,为明确Sirt1与糖尿病性角膜病变的关系奠定基础。 方法：取雄性C51BL/6-Ins2Akita+/J小鼠与同窝出生的野生型雄性C57BL/6-Ins2-/+小鼠各8只,分别作为1型糖尿病模型组和正常对照组。分别于24周龄、28周龄、32周龄、36周龄、40周龄、44周龄、48周龄测量两组小鼠的体重、血糖、泪液分泌情况,同时行虎红染色观察泪膜及上皮情况；于48周龄时颈椎脱臼法处死,取小鼠的三叉神经节和角膜组织。采用苏木素-伊红染色显示两组小鼠的角膜和三叉神经节的组织病理学变化；行免疫组织化学法检测角膜和三义神经节中Sirt1蛋白的表达和定位；行荧光定量PCR法检测Sirt1mRNA在角膜和三叉神经节中的表达；行Western blot检测两组小鼠角膜和三叉神经节中Sirt1蛋白的相对表达量,并进行统计学分析。 结果：与C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠相比,C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的体重明显较轻(t=22.784,P=0.000),泪液分泌减少(t=10.693,P=0.000),虎红染色着色明显。C57BL/6-Ins2Akita+J小鼠的三叉神经节细胞大小不均匀,排列较疏松,神经纤维排列较散乱,角膜上皮变薄、细胞层数减少；而C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠的神经节细胞大小、形态较为均一,排列紧密、整齐,神经纤维排列较整齐。荧光定量PCR显示,Sirt1mRNA在C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜的表达强度显著低于野生型C57BL/6-Ins2+/+小鼠(0.53±0.08vs.0.97±0.12),差异有统计学意义(t=-5.863,P=0.003)；在C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠三义神经节的表达灰度为2.43±0.19,低于野生型C57BL/6-Ins2+/+小鼠(2.50±0.23),但差异无统计学意义(t=0.582,P=0.611).Western blot显示,C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜中Sirt1蛋白的表达明显低于野生型C57BL/6-Ins2+/+小鼠(0.778±0.017vs.1.306±0.014),差异有统计学意义(t=33.141,P=0.001)；但Sirt1蛋白在两组小鼠的三叉神经节中的表达差异无统计学意义(1.100±0.016vs.1.108±0.018,t=0.431,P=0.708). 结论：Sirt1在48周龄1型糖尿病C51BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的角膜中的表达降低,提示Sirt1有可能参与糖尿病性角膜病变。 第二部分过量表达Sirt1蛋白对高糖环境下角膜上皮损伤修复的影响 目的：研究Sirt1对高糖环境下角膜上皮损伤修复的影响及其作用机制。 方法：取雄性C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠20只与同窝出生的野生型雄性C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠5只分成五组：C57BL/6-Ins2+/+野生型小鼠角膜损伤不处理组、C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜损伤不处理组、C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜损伤结膜下注射生理盐水组(1OuL)、C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜损伤结膜下注射Ad-GFP组(10uL滴度为1011的重组GFP腺病毒)和C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜损伤结膜下注射Ad-Sirt1组(10uL滴度为1011的重组Sirt1腺病毒)。角膜上皮刮除后,立即结膜下注射相应物质。损伤48h后,通过Western blot分别比较前两组之问、后四组之间小鼠角膜组织中乙酰化p53、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3蛋白)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、乙酰化的蛋白激酶B (p-AKT)等蛋白的表达量,进而显示过量表达Sirt1对C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠角膜组织中p53、IGFBP3/IGF-1/AKT的表达的影响。通过荧光素钠染色并分别于伤后0h、24h、48h裂隙等下观察并照相显示过量表达Sirt1对糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响。 结果：糖尿病小鼠角膜上皮刮除后,荧光素钠染色结果表明结膜下注射重组SIRT1腺病毒的糖尿病小鼠48小时后角膜上皮损伤愈合的面积显著低于未进行SIRT1腺病毒注射组,说明过量表达Sirt1后促进了糖尿病小鼠角膜的损伤修复。与野生型小鼠相比,糖尿病小鼠的角膜组织中乙酰化p53、IGFBP3蛋白表达明显上调,而Sirt1、IGF-1R、p-AKT显著下调。结膜下注射重组SIRT1腺病毒的C57BL/6-Ins2Akita+/J小鼠的角膜组织中乙酰化p53、IGFBP3蛋白表达较未注射时显著下调,而IGF-1R、乙酰化ATK蛋白表达显著增加,其表达量均与野生型小鼠相当。 结论：Sirt1通过抑制p53乙酰化调控IGFBP3/IGF-1/AKT通路,进而促进角膜上皮修复。Sirt1对糖尿病角膜病变有保护作用。
【关键词】：沉默信号调控因子1 1型糖尿病 糖尿病角膜病变 上皮修复
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R587.2;R772.2
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-9
• 第一部分 沉默信号调控因子1(Sirt1)在1型糖尿病模型小鼠角膜和三叉神经节中的表达9-33
• 引言9-11
• 第一章 实验材料和试剂11-13
• 1.1 实验动物11
• 1.2 仪器11
• 1.3 试剂11-13
• 第二章 实验方法和实验步骤13-20
• 2.1 动物模型及分组13
• 2.2 小鼠体重、血糖的观察13
• 2.3 小鼠泪液分泌的观察13
• 2.4 1%虎红染色角膜上皮损害检测13
• 2.5 苏木素-伊红染色检测三叉神经节与角膜的组织病理学该变13-14
• 2.6 免疫组织化学染色检测Sirt1的表达14-15
• 2.7 SYBR real time PCR法检测Sirt1 mRNA的表达15-17
• 2.8 Western blot检测角膜和三叉神经节中Sirt1蛋白的表达17-19
• 2.9 统计学处理19-20
• 第三章 实验结果20-28
• 3.1 小鼠体重的变化20-21
• 3.2 小鼠血糖变化情况21
• 3.3 小鼠泪液分泌的观察21-22
• 3.4 1%虎红染色情况22-23
• 3.5 苏木精-伊红染色检测三叉神经节与角膜组织的改变23-25
• 3.6 Sirtl蛋白在两组小鼠角膜中的表达25
• 3.7 荧光定量PCR法检测Sirt1 mRNA的表达25-26
• 3.8 Westorn blot检测Sirt1蛋白的表达26-28
• 第四章 讨论28-30
• 4.1 小鼠模型的选择28
• 4.2 1%虎红角膜染色在糖尿病角膜病变中的意义28
• 4.3 检测Sirt1蛋白的意义28-30
• 第五章 结论30-31
• 参考文献31-33
• 第二部分 过量表达Sirt1蛋白对高糖环境下角膜上皮损伤修复的影响33-45
• 引言33-35
• 第一章 实验材料和试剂35-36
• 1.1 实验动物35
• 1.2 仪器35
• 1.3 试剂35-36
• 第二章 实验方法和实验步骤36-37
• 2.1 动物模型及分组36
• 2.2 模型的建立36
• 2.3 荧光素钠染色36
• 2.4 Sirt1、p53以及IGFBP3/IGF-1/AKT通路的检测36
• 2.5 统计学处理36-37
• 第三章 实验结果37-40
• 3.1 荧光素钠染色角膜上皮损伤检测37-38
• 3.2 Western blot检测小鼠角膜各因子表达38-40
• 第四章 讨论40-42
• 第五章 结论42-43
• 参考文献43-45
• 综述45-54
• 参考文献49-54
• 攻读学位期间的研究成果54-55
• 致谢55-56

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本文编号：885805