TGF-β受体抑制剂Compound C对hESC向RPE定向诱导效率的影响

发布时间：2017-09-28 14:37

  本文关键词：TGF-β受体抑制剂Compound C对hESC向RPE定向诱导效率的影响

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【摘要】：研究目的 应用人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells, hESC)来源的视网膜色素上皮细胞(Retinal Pigment Epithelium, RPE)进行体内细胞移植治疗,为视网膜变性疾病患者重见光明带来了希望。然而hESC向RPE细胞诱导分化效率低、成熟周期长、造价高仍然是目前研究的瓶颈。RPE由神经外胚层发育而来,促进hESC向神经外胚层分化,可以提高RPE定向诱导效率。文献报道,转化生长因子-β(TGF-p)超家族受体抑制剂Compound C能提高hESC向神经方向诱导分化效率,抑伟hESC向内胚层、中胚层及滋养外胚层分化。本研究通过在诱导分化培养体系中加入Compound C,观察其对RPE诱导效率的影响,并对hESC来源的RPE (hESC-RPE)细胞特性进行体外验证,为将来hESC来源的RPE移植治疗视网膜变性疾病提供基础。 方法 将H1hESC分为对照组和Compound C处理组。对照组在细胞过度融合后,以去除碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的血清替代物(KOSR)培养体系诱导RPE定向分化；Compound C处理组于诱导分化前6d在培养体系中加入1uMCompound C。在诱导分化第1、3、5周,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组人类配对盒基因(PAX6)、小眼球相关转录因子(MITF)、细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)、RPE65mRNA的表达。将hESC-RPE细胞分离纯化,采用RT-PCR、蛋白免疫印迹法(Western blot)、细胞免疫荧光法和吞噬实验对纯化的hESC-RPE细胞进行体外鉴定。 结果 1、在诱导分化第4周,Compound C处理组肉眼可见黑色素团块出现,而对照组无色素团块出现。诱导分化第5周,Compound C处理组可见多个色素细胞团,对照组刚开始出现色素团块。 2、RT-PCR检测结果显示,Compound C处理组PAX6mRNA表达在诱导分化第1、3周显著高于对照组,差异有统计学意义(t=28.498、3.141,P0.05)。诱导分化第3、5周,Compound C处理组MITF(t=8.866、10.111). CRALBP(t=5.293、5.394)和RPE65(t=9.263、9.504)的表达均明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。 3、将Compound C处理组的色素细胞分离纯化后,显微镜下可见所培养的细胞均为多角形细胞形态,细胞质充满色素颗粒。 4、RT-PCR检测结果显示,hESC-RPE细胞分别与hESC、ARPE19细胞相比,PAX6、MITF、CRALBP、RPE65表达均显著增高,差异有统计学意义(PAX6: t=9.154,7.605, P0.05; MITF:t=l7.284,16.770, P0.05; CRALBP:t=18.204,18.190, P0.05; RPE65:t=44.194, t=44.190, P0.05)。 5、Western blot检测结果显示,hESC-RPE细胞高水平表达RPE标志蛋白PAX6、 MITF、CRALBP、RPE65。 6、细胞免疫荧光检测结果显示hESC-RPE细胞能表达RPE细胞特异性标志蛋白PAX6、MITF、CRALBP、RPE65、ZO-1。 7、吞噬实验显示,hESC-RPE细胞能吞噬聚苯乙烯荧光微球,具有吞噬功能。 结论 TGF-β受体抑制剂Compound C能显著提高hESC向RPE细胞定向诱导效率。hESC-RPE细胞具备RPE典型的多角形、色素化外观,能高表达RPE标志基因和蛋白,具有吞噬功能。hESC-RPE细胞表达RPE标志基因和标志蛋白显著好于ARPE19细胞系,更加适合细胞移植治疗视网膜变性疾病,为视网膜变性疾病的研究提供了更好的细胞平台。
【关键词】：转化生长因子-β Compound C 人胚胎干细胞 视网膜色素上皮定向诱导
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R774.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• ~.略语/符号说明10-11
• 前言11-13
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 1.1 实验材料与器械13-17
• 1.1.1 实验所用的细胞13
• 1.1.2 实验所用的试剂13-14
• 1.1.3 实验所用的抗体14-15
• 1.1.4 实验所用的主要仪器和设备15-16
• 1.1.5 细胞培养体系及主要试剂配制16-17
• 1.2 方法17-25
• 1.2.1 人胚胎干细胞培养、传代及冻存17-18
• 1.2.2 分组比较hESC向RPE细胞诱导效率18
• 1.2.3 hESC-RPE细胞分离提纯及传代18-19
• 1.2.4 ARPE-19细胞系传代、冻存及复苏19-20
• 1.2.5 细胞总RNA提取20-21
• 1.2.6 细胞总RNA逆转录21
• 1.2.7 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应21-23
• 1.2.8 蛋白免疫印迹法鉴定hESC-RPE细胞23-24
• 1.2.9 细胞免疫荧光法鉴定hESC-RPE细胞24
• 1.2.10 hESC-RPE细胞吞噬功能检测24
• 1.2.11 统计学处理24-25
• 1.3 结果25-33
• 1.3.1 H1 hESC形态学特征25
• 1.3.2 形态学观察比较对照组和CompoundC处理组诱导效率25-26
• 1.3.3 PAX6、MITF、CRALBP、RPE65 mRNA在对照组和CompoundC处理组中的表达26-27
• 1.3.4 hESC-RPE细胞分离纯化27-28
• 1.3.5 ARPE-19细胞系形态学特征28
• 1.3.6 PAX6、MITF、CRALBP、RPE65 mRNA在hESC、ARPE-19、hESC-RPE细胞中的表达28-29
• 1.3.7 PAX6、MITF、CRALBP、RPE65蛋白在hESC、ARPE-19、hESC-RPE细胞中的表达29-30
• 1.3.8 hESC-RPE细胞免疫荧光结果30-32
• 1.3.9 hESC-RPE细胞吞噬功能检测结果32-33
• 1.4 讨论33-39
• 1.4.1 hESC向RPE细胞定向诱导分化33-34
• 1.4.2 RPE细胞标志基因和蛋白：Pax6、MITF、CRALBP、RPE6534-35
• 1.4.3 Compound C促进hESC向RPE细胞定向诱导分化35-37
• 1.4.4 hESC-RPE细胞分离提纯37
• 1.4.5 hESC-RPE细胞功能鉴定37-39
• 1.5 小结39-40
• 结论40-41
• 参考文献41-46
• 发表论文和参加科研情况说明46-47
• 综述47-60
• 综述参考文献55-60
• 致谢60

【共引文献】

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本文编号：936419