大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化角膜内皮细胞可行性的研究

发布时间：2017-10-05 08:44

本文关键词：大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化角膜内皮细胞可行性的研究

【摘要】：目的：通过体外培养的方法，培养大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrowmesenchymal stem cells,rBMSCs)，掌握其细胞的生长特性，，并利用体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向角膜内皮细胞分化，检测神经元特性烯醇化酶（neuronspecific enolase,NSE）、Na+-K+-ATP酶活性蛋白的表达，检测对流式抗体CD31和CD34的表达，探讨大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养向角膜内皮样细胞分化的可行性。方法： 1.选取大连医科大学动物实验室的SD大鼠，利用Percoll分离液分离出rBMSCs并体外培养、扩增，观察其形态，通过流式细胞仪检测CD29、CD105、CD44、CD34抗体对rBMSCs进行鉴定。 2.将rBMSCs按照2×105/ml密度种植在12孔板内，分诱导组和空白对照组进行对比培养，3d后铺满瓶底约80%左右,将含有表皮生长因子（epidermal growthfactor, EGF）10ng/ml、成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）30ng/ml等诱导剂加入到培养基中进行诱导分化培养，2d换一次液，诱导周期为3周。 3.3周后利用免疫荧光法检测诱导后rBMSCs的Na+-K+-ATP酶的活性表达，免疫组化检测方法检测NSE的表达，流式细胞仪检测内皮细胞标志物CD31、CD34的表达。结果： 1.分离后的rBMSCs呈漩涡状排列，中央细胞呈三角形及短梭形；流式细胞仪检测结果显示，其表面抗原CD29、CD105、CD44的表达率分别为：85.0%，90.5%，90.7%；CD34抗体检测结果显示，阳性表达率为：1.2%，成功分离并培养rBMSCs； 2.显微镜下观察诱导后2周的rBMSCs部分细胞呈多边形具有内皮细胞形态特征，3周后rBMSCs呈“铺路石子”状，多为六边形。同时免疫荧光染色实验显示诱导组CD31阳性率为(10.48±0.19）%，细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达的阳性率为（16.71±1.85）%，胞浆见棕黄色粗大颗粒，染色阳性，阳性反应集中在细胞核部位；空白对照组均不表达CD31及NSE，诱导组与空白组比较差异有显著性（X2=23.17， p0.05）；诱导组Na+-K+-ATP酶活性测定结果为(0.231±0.107)U/mgprot，空白对照组对Na+-K+-ATP酶无活性，诱导组与空白组比较差异具有统计学意义（t=41.67，p 0.01）。流式细胞仪检测诱导组CD31和CD34表面抗原检测阳性表达率分别为：85.6%，92.4%；空白组CD31和CD34表面抗原检测阳性表达率分别为：1.2%，1.4%。结论：体外成功分离大鼠骨髓间充质干细胞；大鼠骨髓间充质干细胞具有向角膜内皮细胞分化的潜能，经诱导后的骨髓间充质干细胞可表达NSE、Na+-K+-ATP酶活性和流式抗体CD31、CD34的表达均阳性；诱导分化后的骨髓间充质干细胞可作为种子细胞，使临床移植角膜内皮细胞成为可能。
【关键词】：角膜内皮细胞 骨髓间充质干细胞 分化大鼠
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R772.2
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