减毒沙门氏菌介导的Apoptin对喉癌的抑制效应研究

发布时间：2017-10-06 09:08

  本文关键词：减毒沙门氏菌介导的Apoptin对喉癌的抑制效应研究

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【摘要】：本研究基于我们先前对凋亡素（Apoptin）基因的研究，，利用减毒沙门氏菌载体系统，构建了具有肿瘤特异杀伤能力和肿瘤特异增殖能力的重组减毒沙门氏菌。 目的: 探讨重组减毒沙门氏菌对喉癌细胞Hep-2的体外抑制作用，研究其对裸鼠荷人喉癌动物模型实体肿瘤的体内抑制效应。为研发安全、靶向、高效和无耐药的新型抗喉癌基因治疗候选药物奠定物质和理论基础，并为喉癌基因治疗的基础和应用研究积累经验。 方法: 通过电转移和抗生素加压筛选等步骤获得含有Apoptin基因的重组减毒沙门氏菌（rC-Apoptin）。以rC-Apoptin感染体外培养的人喉癌细胞Hep-2，通过western blot、RT-PCR等方法对外源基因Apoptin的表达进行验证；通过MTT检测其对体外培养的Hep-2细胞的抑制作用；利用AO/EB染色在体外细胞培养水平验证rC-Apoptin诱导Hep-2细胞凋亡的功能。建立裸鼠荷人喉癌动物模型，尾静脉注射重组减毒沙门氏菌，通过检测抑瘤率、生存期、肿瘤生长趋势等方法研究重组减毒沙门氏菌对体内人喉癌实体肿瘤的抑制作用；分离裸鼠荷人喉癌模型动物肿瘤组织，通过组织切片，利用光学显微镜观察rC-Apoptin对实体肿瘤的抑制作用；通过细菌分布分析和对多脏器组织切片观察，了解沙门氏菌在机体的分布以及对其他脏器的影响。 结果: 表达Apoptin基因的重组减毒沙门氏菌所携带外源基因可在Hep-2细胞内有效表达。rC-Apoptin对体外培养的Hep-2细胞具有杀伤作用，并且其杀伤作用存在一定的量效和时效关系。rC-Apoptin能够有效抑制体内实体喉癌的生长，延长动物生存期，重复注射rC-Apoptin可明显延长肿瘤倍增时间（TDT，tumordoubling time）延长肿瘤迟滞时间(TGD，tumor growth delay)。重组减毒沙门氏菌在肿瘤组织的富集量是肝脏富集量的1000倍。且该重组减毒沙门氏菌未对模型动物肝、肺和肾等器官造成不良影响。 结论： 成功构建了表达Apoptin的重组减毒沙门氏菌rC-Apoptin。rC-Apoptin感染Hep-2后能有效表达外源基因Apoptin。rC-Apoptin能够有效抑制在体外培养的人喉癌细胞Hep-2的生长，并且这种抑制作用在高剂量条件下呈现时间效应依赖关系；在较长感染周期条件下呈现剂量效应依赖关系。rC-Apoptin不仅具有抑制模型动物Hep-2实体喉癌生长的功能，还可以有效提高模型动物生存率。
【关键词】：减毒沙门氏菌 凋亡素 喉癌 细胞凋亡 肿瘤特异性
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.65
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文缩略词表12-14
• 第1章 引言14-16
• 第2章 文献综述16-23
• 2.1 CAV 与 Apoptin16-17
• 2.1.1 CAV 及 Apoptin 的来源16-17
• 2.1.2 Apoptin 的结构与生物学特性17
• 2.2 Apoptin 诱导细胞凋亡17-19
• 2.2.1 Apoptin 诱导凋亡的细胞类型17-18
• 2.2.2 Apoptin 的穿梭功能和细胞核定位功能18
• 2.2.3 Apoptin 的肿瘤特异性磷酸化18-19
• 2.2.4 Apoptin 与神经酰胺19
• 2.3 Apoptin 诱导细胞凋亡的机制19-20
• 2.3.1 Apoptin 与 p5319-20
• 2.3.2 Apoptin 与 Bcl-220
• 2.4 Apoptin 与肿瘤治疗20-22
• 2.5 结语22-23
• 第3章 材料和方法23-30
• 3.1 实验材料23-24
• 3.1.1 质粒、细菌、细胞及小鼠23
• 3.1.2 主要试剂23
• 3.1.3 仪器设备23-24
• 3.2 实验方法24-30
• 3.2.1 表达 Apoptin 的重组减毒沙门氏菌的构建及在 Hep-2 细胞中的表达24-27
• 3.2.2 重组减毒沙门氏菌对体外培养的 Hep-2 细胞的抑制作用1427-28
• 3.2.3 重组减毒沙门氏菌的体内抑制喉癌作用28-30
• 第4章 实验结果30-42
• 4.1 表达 Apoptin 的重组减毒沙门氏菌的构建及在 Hep-2 细胞中的表达30-33
• 4.1.1 重组质粒的构建与鉴定30-31
• 4.1.2 间接免疫荧光检测31
• 4.1.3 RT-PCR31-32
• 4.1.4 Western blot32-33
• 4.2 重组减毒沙门氏菌对体外培养的 Hep-2 细胞的抑制效应33-37
• 4.2.1 感染剂量对重组减毒沙门氏菌作用的影响33-35
• 4.2.2 感染时间对重组减毒沙门氏菌作用的影响35-36
• 4.2.3 AO/EB 染色分析36-37
• 4.3 重组减毒沙门氏菌的体内抑制喉癌作用37-42
• 4.3.1 治疗后各组小鼠临床症状和肿瘤生长趋势37-38
• 4.3.2 模型动物生存期38-39
• 4.3.3 肿瘤倍增时间(TDT)和肿瘤生长延迟时间 (TGD)39-40
• 4.3.4 细菌分布40-41
• 4.3.5 组织切片观察41-42
• 第5章 讨论42-46
• 第6章 结论46-47
• 参考文献47-53
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果53-54
• 致谢54

【共引文献】

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本文编号：981914