LMP1瞬时过表达对鼻咽癌CNE2细胞迁移的影响及其作用机制的探讨

发布时间：2017-10-07 06:08

  本文关键词：LMP1瞬时过表达对鼻咽癌CNE2细胞迁移的影响及其作用机制的探讨

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【摘要】：目的:鼻咽癌是我国南方高发恶性肿瘤，EB病毒感染几乎与所有未分化和低分化鼻咽癌都有关，EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latent membraneprotein1，LMP1)是近年研究病毒在人类致癌作用中受到关注的蛋白。LMP1蛋白可控制细胞的增殖和凋亡，使上皮细胞发生转化，，对肿瘤的发生、发展、转移产生重要影响，但其相关的信号通路较为复杂，具体机制尚不明了。本研究构建可在真核细胞中表达LMP1的增强荧光表达载体，观察其在鼻咽癌细胞CNE2中的表达，探讨潜伏膜蛋白LMP1瞬时过表达对CNE2细胞迁移的影响及其作用机制，以期为丰富鼻咽癌发生发展的分子机制提供一定的理论和实验基础。 方法:根据GenBank中LMP1基因mRNA全长序列设计合成引物，Trizol法提取人鼻咽癌细胞株C15的总RNA，逆转录成cDNA。PCR技术扩增出目的片段。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后分离，切胶回收纯化，获得LMP1基因片段。LMP1基因片段经双酶切亚克隆到pEGFP-C1质粒载体，构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体。重组质粒经双酶切和测序鉴定。利用脂质体介导的方法将pEGFP-C1-LMP1体外瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞，激光共聚焦显微镜观察转染细胞中LMP1蛋白的表达情况及其在细胞内定位。CCK-8法检测转染pEGFP-C1-LMP1后鼻咽癌CNE2细胞的生长活力。流式细胞术检测细胞周期。Transwell小室观测转染后CNE2细胞迁移和侵袭能力的变化。实时荧光定量PCR及蛋白印迹技术检测LMP1及细胞迁移运动相关因子Rac1mRNA和蛋白的表达情况。 结果:重组载体经Sal和BglⅡ双酶切后，行1.5%琼脂糖凝胶电泳，可见一条与理论预测值（1170bp）一致的目的条带。DNA序列鉴定证实插入片段与GenBank提供的序列一致。将pEGFP-C1-LMP1瞬时转染鼻咽癌细胞株CNE2后，激光共聚焦显微镜下可见GFP对照组绿色荧光蛋白广泛分布在胞浆中，而GFP-LMP1主要定位于CNE2细胞的胞膜和部分胞浆中。CCK-8实验显示，与GFP对照组相比，pEGFP-C1-LMP1转染组细胞活力增强（P＜0.05）。流式细胞术检测显示：pEGFP-C1-LMP1组与GFP对照组相比，在G1、S期细胞数有差异（P＜0.05）。细胞侵袭实验GFP对照组和pEGFP-C1-LMP1转染组所测OD值分别为:0.1160±0.009，0.066±0.0097，差异具有统计学意义（P＜0.001）。在迁移实验中，GFP对照组和pEGFP-C1-LMP1转染组发生迁移的细胞个数分别为:99.3±13.05和63.0±8.54，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Real-time PCR显示：和GFP组相比， pEGFP-C1-LMP1转染组LMP1mRNA的表达量明显增高，Rac1mRNA表达降低；PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测显示，在导入LMP1的CNE2细胞中可见一明显条带，而GFP组未见，Rac1mRNA在pEGFP-C1-LMP1转染组中的表达较GFP组明显减弱。免疫印迹显示LMP1蛋白的表达在GFP对照组呈阴性,而在目的基因转染组呈阳性；目的基因转染组转染后24h可检测到LMP1的表达，48h表达升高，72h后表达略为减弱，而Rac1则在目的基因转染后的48h和72h表达均出现下调。 结论：成功构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体，并在LMP1阴性的人类低分化鼻咽癌CNE2细胞株中表达。LMP1瞬时过表达可抑制鼻咽癌细胞CNE2的侵袭和迁移，可能与Rac1表达下调有关。
【关键词】：LMP1 鼻咽肿瘤 真核表达载体 瞬时转染 肿瘤迁移 rac1GTP结合蛋白质
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 英汉缩略词对照表10-12
• 前言12-14
• 1 材料与方法14-45
• 2 结果45-53
• 3 讨论53-61
• 4 结论61-62
• 参考文献62-65
• 攻读学位期间发表的学术论文目录65-66
• 致谢66-67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：987315