毛干中线粒体DNA 4977bp缺失突变与老年性聋功能损害程度的关系

发布时间：2017-10-07 22:23

  本文关键词：毛干中线粒体DNA 4977bp缺失突变与老年性聋功能损害程度的关系

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【摘要】：目的： 通过检测人毛干线粒体DNA的状态及缺失突变情况,探讨毛干线粒体DNA4977bp缺失突变与老年性耳聋的关系,进一步阐明毛干线粒体DNA的获得性损伤在老年性耳聋发病中的意义。 方法： 1、病例选择：收集山东大学附属省立医院耳鼻咽喉头颈外科门诊2013年6月至2013年11月就诊的老年性耳聋患者,通过问卷调查和严格的听力筛查项目(纯音听阈和鼓室图)来收集样本。纳入研究标准：受试者必须是双侧、感音神经性听力损失；受试者双侧听力在同一频率差异在10分贝以内；每个受试者纯音听阈阈值增加26分贝以上；每位受试者鼓室图显示没有明显其它能引起听阈增高的病变。调查问卷详细地包括了受试者以往的药物史、家族史、既往及现病史,排除有明确的其它引起听力损失疾病的就诊者。 2、毛干总线粒体DNA的提取：每位纳入研究的受试者收集4-6根毛干,使用chelex-100法提取毛干中线粒体DNA。 3、普通PCR：使用普通PCR方法进一步验证毛干中线粒体DNA提取成功。 4、巢式PCR：采用巢式PCR检测患者毛干中线粒体DNA状态及线粒体DNA4977bp缺失比率。 5、DNA测序：使用ABI3730型自动测序仪对巢式PCR扩增的DNA缺失片段进行测序,进一步验证缺失片段为线粒体DNA4977bp。 6、实时定量荧光PCR：检测受试者毛干中线粒体DNA4977bp缺失程度,观察线粒体DNA4977bp缺失突变率与老年人群听力功能受损程度的关系。 结果： 1、经过严格听力检测及问卷调查标准筛选的87例单纯性老年性耳聋患者(60-83岁)和95例听力正常老年人(63-81岁)为对象,每位受试者收集4-6根毛干。 2、普通PCR结果显示：所有标本均可扩增出135bp线粒体DNA保守片段,表示每位受试者毛干提取DNA均为线粒体DNA。 3、巢式PCR结果显示：线粒体DNA4977bp缺失突变阳性标本首次PCR可以扩增出618bp的目标片段,而未发生缺失突变的DNA样本由于Taq酶功能的限制和延伸时间不足的限制不能扩增出长约5kb的片段；经首次PCR证实缺失突变阳性的标本,再次PCR,可扩增出396bp的目标片段。老年性聋组线粒体DNA4977bp缺失突变发生率为59/87。其中,听力损失在26-55dB之间,表现为轻中度听力损失患者,缺失突变发生率为22/43；听力损失在56-90dB之间以全频损失,表现为中重度、重度听力损失患者,缺失突变发生率为25/31；听力损失90dB,表现为极重度听力损失的患者,缺失突变发生率为12/13。而听力损失26dB,表现为听力正常组线粒体DNA4977bp缺失突变发生率8/95。Pearson相关系数分析结果显示,线粒体DNA4977bp缺失突变与听力损失严重程度之间存在着明显相关性(r=0.858；P0.050)；卡方分析结果显示不同组之间线粒体DNA4977bp缺失突变阳性率有明显统计学差异(F=47.145；P=0.000)。 4、经ABI3730型自动测序仪对巢式PCR扩增的DNA缺失片段进行测序,结果显示缺失片段为线粒体DNA4977bp。 5、实时荧光定量PCR表明：轻中度听力损失组,中重度、重度听力损失组,极重度听力损失组及正常听力组线粒体DNA缺失量分别为11.97±4.12%、19.75±5.29%、33.68+10.30%、4.91±4.16%。四组之间的差异有明显的统计学意义(P0.050),而且老年性耳聋患者存在线粒体DNA4977bp缺失,且听力损失越严重,缺失量越明显(P0.050)。在8kHz(r=0.778,P0.050)和各频率平均听力损失(r=0.858,P0.050)患者均表现出该现象。结论： 1、老年性耳聋患者及正常听力老年人群毛干中均存在线粒体DNA4977bp缺失突变； 2、老年性耳聋患者毛干线粒体DNA4977bp缺失突变率明显高于正常听力老年人群； 3、老年人群听力功能受损程度与患者毛干线粒体DNA缺失突变量呈正相关。
【关键词】：老年性聋 毛干 常见缺失 巢式PCR 测序 实时定量PCR
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R764.436
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• ~.略词表12-13
• 前言13-15
• 材料和方法15-19
• 实验步骤19-23
• 结果23-25
• 讨论25-30
• 附图30-33
• 参考文献33-38
• 综述38-49
• 参考文献46-49
• 致谢49-50
• 发表论文50-51
• 学位论文评阅及答辩情况表51

【参考文献】

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本文编号：990408