基于HER2靶标的抗体偶联药物（ADCs）内吞机制研究

发布时间：2017-10-10 20:36

  本文关键词：基于HER2靶标的抗体偶联药物（ADCs）内吞机制研究

  更多相关文章： SPR技术 HER2受体 抗体偶联药物 内吞

【摘要】：乳腺癌已成为威胁女性生命健康的重要疾病之一,且患乳腺癌的女性数量逐年增高,其中20-30%是HER2过表达型患者。HER2作为一种临床验证的癌症靶标,治疗HER2过量表达肿瘤的药物是科学界研究的热点。目前治疗性单抗由于具有靶向性好、自身异源性低及毒副作用低等优点,在乳腺癌的临床治疗中应用广泛。但由于一部分HER2阳性的乳腺癌患者对单抗治疗不敏感,同时伴随着耐药性的产生,从而为其临床治疗提供了挑战。由此,治疗HER2过表达的抗体偶联药物(Antibody-drugs conjugates,ADCs)应运而生。ADCs是一类新型、高效的治疗肿瘤的药物,并以其优良的研究效果和低毒性成为乳腺癌治疗的新星。抗HER2的ADCs以抗体为载体,通过偶联剂与细胞毒性药物连接,利用抗体特异性识别靶细胞,细胞毒药物靶向作用从而发挥强抗肿瘤作用。ADC药物的作用机制是当抗体与肿瘤靶点结合后,ADCs进入肿瘤细胞,在细胞内裂解释放效应分子并引起细胞的凋亡。而ADCs高效杀伤肿瘤细胞的效应依赖于其是否能够特异、有效地进入肿瘤细胞,及细胞毒药物能否有效释放,因此研究其内吞,胞内转运,清除在药物评价中十分重要。但目前,对HER2介导的内吞和胞内转运的机制仍知甚少。本课题选用的治疗HER2过表达型乳腺癌ADCs作为研究对象,即T-DM1(Trastuzumab与DM1通过硫醚键连接)、P-DM1(Pertuzuma与DM1通过硫醚键连接)、P-MMAE(Pertuzumab通过二肽键偶联MMAE)、WBP265(曲妥珠单抗引入非天然氨基酸的265SD单抗与MMAF偶联)。其中T-DM1已于2013年上市,P-DM1、P-MMAE、WBP265均为正在研发的新药。通过监测单抗、细胞毒药物、偶联键等因素,对ADCS与受体相互作用以及它们在体外结合的影响,验证上述因素是否对它们的内吞速率和清除速率有影响,进一步阐述它们的作用机制。本文分为两部分,第一部分研究抗体偶联药物与HER2受体间的相互作用,第二部分研究抗体偶联药物在体外的内吞机制。第一部分研究不同ADCs与HER2受体间的相互作用。首先用SPR技术测定这些抗体与抗原相互作用。本文采用的是捕获法,具体实验方法:利用氨基氨基偶联试剂盒将抗人Ig G(Fc)抗体偶联到CM5传感芯片葡聚糖基质表面,首先注射待测样品于检测通道,然后将HER2受体溶液(HBS-EP+缓冲液五个等梯度稀释液)注射于检测通道和参比通道,使得其与药物相结合;最后注射3M Mg Cl2进行芯片再生以备下一循环使用。用检测通道的响应值减去参比通道响应值,以扣除非特异性结合、补偿折射率所带来的误差。设置单循环动力学分析方法并运行。所得的曲线采用1:1 Lamgmuir模型描述拟合动力学模型,Biaevaluation分析软件进行数据处理,计算供试品的亲和动力学。KD值越小,抗原抗体的亲和力越大。用Biacore T200检测ADCs及阳性对照物(单抗:Trastuzumab、Pertuzumab、265SD)与受体HER2的KD值在10-10左右,故均具有很高的亲和力,活性高。根据Biacore判定标准一般认为KD值相差五倍以内,可以判定为亲和能力没有差别。T-DM1(KD值为133.9 p M)与HER2的亲和力相当于Trastuzumab(KD值为94.2 p M);P-DM1、P-MMAE与HER2的亲和力(P-DM1 KD值为722.1 p M,P-MMAE KD值为326.7 p M)大于Pertuzumab与HER2的亲和力(KD值为1191 p M),其中P-MMAE又强于P-DM1;同时单抗265SD与配体的亲和力与WBP265相当(265SD KD值为606.6 p M,WBP265KD值为577.3 p M)。与受体的亲和力,T-DM1和WBP265SD等于其对应的单抗,说明单抗连接小分子药物后对亲和力影响不大;但是连接效应分子后,对帕妥珠单抗影响较大,亲和力发生了较大影响。三种单抗与HER 2的亲和力是Trastuzumab最强,265SD稍强,Pertuzumab最弱。同时T-DM1与HER 2的亲和力大于P-DM1,因为T-DM1结合速率远大于P-DM1。接着,采用免疫荧光的方法分别测定ADCs、单抗与HER2的体外结合性质。流式细胞仪结果可见抗体与受体结合存在量效关系,在浓度0.3125-20μg/ml范围内,随着供试品浓度的增加,平均荧光强度(MFI)逐渐增强,浓度到达20μg/ml后,供试品浓度增加,荧光强度不变,符合受体的结合特征,即配体与受体结合具有饱和性。通过ADCs、单抗分别与HER2的结合曲线可知:T-DM1与HER2结合能力稍弱于Trastuzumab;P-DM1、P-MMAE弱于Pertuzumab,但P-MMAE稍强于P-DM1;WBP265弱于265SD。比较不同单抗其他结构相同的T-DM1、P-DM1的结合曲线可知,P-DM1稍大于T-DM1。比较三种单抗的结合能力,265SD最强,Pertuzumab其次,Trastuzumab最弱。第二部分研究不同ADCS在体外的内吞机制。研究发现,ADCS内吞进入胞内后,在溶酶体中降解。首先采用激光扫描共聚焦显微镜实时检测ADCs药物在SKBR3细胞中的转运和内吞速率,阳性细胞经T-DM1处理4小时后内吞进入到溶酶体,而单抗曲妥珠处理2小时到达溶酶体,说明T-DM1的内吞速率小于Tratuzumab;P-DM1与细胞共培养6小时后内吞进入溶酶体,P-MMAE处理8小时内吞到达溶酶体,而帕妥珠单抗4小时处理后,内吞到达溶酶体,说明P-DM1、P-MMAE的内吞速率小于Pertuzumab;而抗体偶联物WBP265和265SD单抗与细胞共培养8小时后均到达溶酶体,说明两者的内吞速率相同。在阴性细胞MCF7中,未观察到内吞现象。综合可知,抗HER2的抗体偶联药物的内吞速率小于其单抗的内吞速率。这一结果与体外结合性质研究的结果一致。接着应用免疫荧光的方法测定ADCs和单抗体外清除率。流式细胞仪结果显示,四种不同ADCs在乳腺癌SKBR3细胞内,平均荧光强度随着孵育时间延长而减弱,对比4℃处理条件下一直未变的平均荧光强度,表明ADCs内吞进入细胞后被降解。同时从体外消除曲线,可得出T-DM1的清除率小于曲妥珠单抗的清除率;P-DM1、P-MMAE的清除率小于帕妥珠单抗的清除率;WBP265的清除率小于265SD单抗的清除率。即抗体偶联药物的清除率普遍小于单抗的清除率。这一研究结果与体外结合性质、内吞速率实验一致。综上,本文应用SPR技术揭示ADCs及其相应地单抗与受体的相互作用的基本规律,观察其亲和动力学特征,进一步在体外应用免疫荧光的方法测定结合性质,为在分子、细胞水平上深刻理解乳腺癌导向治疗的机制、合理制定导向治疗方案及未来主攻方向等提供了重要理论依据。本研究中通过比较其清除率和内吞速率,为内化细胞生物学理论增添了新的内容,对药物机制研究、抗体偶联药物的最终优化和临床应用具有重要的指导意义。
【关键词】：SPR技术 HER2受体 抗体偶联药物 内吞
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-19
• 第一章 抗体偶联药物与HER2受体间的相互作用19-38
• 第一节 基于SPR法测定抗体偶联物与HER2受体的亲和力19-29
• 1.实验试剂和仪器19-20
• 2 实验方法20-21
• 3 实验结果21-28
• 4 小结28-29
• 第二节 抗体偶联药物的荧光素标记及定量29-32
• 1 实验试剂和仪器29
• 2 实验方法29
• 3 实验结果29-31
• 4 小结31-32
• 第三节 流式细胞仪测定抗体偶联药物与HER 2 受体的结合32-38
• 1 实验试剂和仪器32
• 2 实验方法32-33
• 3 实验结果33-37
• 4 小结37-38
• 第二章 抗体偶联药物在体外的内吞实验38-51
• 第一节 抗体偶联药物在体外SKBR3细胞的的定位实验38-46
• 1.实验试剂和仪器38
• 2 试验方法38
• 3 实验结果38-45
• 4 小结45-46
• 第二节 抗体偶联药物在体外的清除率实验46-51
• 1.实验试剂和仪器46
• 2 试验方法46
• 3 实验结果46-50
• 4 小结50-51
• 讨论51-54
• 结论54-55
• 参考文献55-62
• 个人简历62-63
• 致谢63

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本文编号：1008518