纳米级超声造影剂制备及其初步应用

发布时间：2017-10-11 11:44

  本文关键词：纳米级超声造影剂制备及其初步应用

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【摘要】：目的通过控制脂质体薄膜的厚度,在不需要制备纳米级和微米级混合超声造影剂(Ultrasound contrast agents,UCA)或者添加表面活性剂的条件下,直接制作出粒径均一纯的脂质纳米级超声造影剂简称纳米气泡,进一步分别检测:1、其粒径、电位、稳定性等理化特性。2、离心对纳米气泡的影响。3、纳米气泡的细胞毒性。最后,通过与已商品化的微米级气泡造影剂——声诺维进行体、内外成像效果对比,评价纳米气泡增强显影的效果及优势。方法纳米气泡制作方法为薄膜水化法。将7mg,14mg,21mg,28mg固定比例的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG(2000))分别加入4个25ml旋蒸瓶。再分别向4个旋蒸瓶内各加入2ml氯仿,震荡旋蒸瓶使脂质体充分溶解。在此步骤,可加入少量红色荧光染料Di I,为后续纳米气泡荧光检测准备。若加入在荧光染料Di I,后续步骤需进行避光处理,以防止荧光染料淬灭。在55℃,120rpm/min条件下,各旋蒸瓶在旋转蒸发仪上旋转蒸发10min,各瓶内形成薄膜,随着脂质体用量增加,薄膜厚度增加。四个旋蒸瓶分别加入0.5ml,1ml,1.5ml,2ml水合液(10%甘油与90%PBS(V/V))后,将旋蒸瓶置于恒温摇床内,在37℃,130rpm/min条件下震荡1小时,形成脂质体悬液。取少量悬液做扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)检测。每个旋蒸瓶内取0.5ml悬液置于密闭小管内,抽空小管内的气体,并注入八氟丙烷(C3F8)。将小管放入银汞调和器中震荡45秒后,形成的乳白色液体。加入PBS将每个小管内的乳白色液体稀释至8ml。每组样本各取2ml,动态光散射仪(Dynamic Light Scattering,DLS)检测其粒径及电位,并取2ml声诺维作为对照组。根据DLS结果,取少量纳泡(14mg DPPC和DSPEPEG(2000)制备)及声诺维进行SEM检测及荧光显微镜观测。将纳米去泡置于25℃条件下,分别于1min,15min,30min,45min和60min后检测其粒径及浓度,评估纳米气泡的稳定性。根据DLS结果,取纳米级与微米级混合造影剂(21mg DPPC和DSPEPEG(2000)制备),分别在20g,50g和805g条件下离心5分钟,检测其粒径。利用MTT法检测脂质体的细胞毒性。在体外观测纳米气泡与声诺维的增强成像效果,利用软件Image J采集灰阶值,进行统计学分析。建立荷瘤裸鼠模型,经尾静脉注入纳米气泡及声诺维,记录增强显影图像,并利用软件进行灰阶值采集,进行统计学分析。取荷瘤裸鼠的肿瘤和肌肉,制作病理切片,荧光标记血管、细胞核,利用激光扫描共聚焦(confocal laser scan microscopy,CLSM)观测带荧光的纳米气泡和声诺维组织位置。结果4组样本的粒径分别为565.2±201.5nm(n=3),457.9±113.8nm(n=3),960.8±59.5nm(n=3),1121.1±57.0nm(n=3),声诺维的粒径为1614.8±224.7nm(n=3)。纳米气泡(14mg DPPC和DSPE-PEG(2000)制备)的电位结果为-21.48±7.46 m V(n=3),而声诺维的电位结果为-32.29±13.13 m V(n=3)。统计学分析后显示,两者没有统计学差异(P=0.283)。SEM观测下,纳泡与声诺维的形态相似,均为单一类圆形空洞,大小与DLS结果基本相同,脂质体为类圆形小球。稳定性结果显示,在25℃条件下,纳米气泡在制作后1min,15min,30min,45min和60min粒径分别为457.9±113.8 nm(n=3),504.3±74.1 nm(n=3),519.5±95.5 nm(n=3),625.9±100.6 nm(n=3)和709.5±272.0 nm(n=3),浓度分别为10.01×106±1.75×106/ml(n=5),9.31×106±1.22×106/ml(n=5),8.22×106±1.17×106/ml(n=5),7.96×106±1.09×106/ml(n=5)和6.07×106±1.20×106/ml(n=5)。统计学分析后发现,60min后产生统计学差异。对纳米级与微米级混合造影剂(14mg DPPC和DSPE-PEG(2000)制备)进行离心后发现,历经均有增大,20 g结果为828.4±425.7 nm(n=3),50 g离心结果为882.1±417.6 nm(n=3),805 g离心结果为977.2±65.9 nm(n=3)。MTT法检测脂质体细胞毒性结果显示:当脂质体浓度增加到10μg/ml时出现明显毒性,而纳米气泡体内成像时的脂质体浓度小于5μg/ml。体外成像结果经Image J采集灰阶值后,纳米气泡为58.482±28.192d B(n=5),声诺维为52.861±11.491 d B(n=5)。T检验分析,两者并无统计学差异。荷瘤小鼠体内成像结果显示,经尾静脉注射后,纳泡与声诺维均有增强显影。声诺维和纳米气泡均在注射后30秒达到峰值。纳泡成像持续时间长于声诺维。两者在2min时产生统计学差异,纳米气泡成像强于声诺维。病理切片CLSM结果显示纳米气泡组肿瘤组织血管外细胞间有红色荧光,而肌肉组织切片内无红色荧光;声诺维组仅在肿瘤组织血管中见少量红色荧光,而细胞间未见红色荧光。结论利用25ml旋蒸瓶,14mg DPPC和DSPE-PEG(2000),通过薄膜水化法可以制作出厚度合适的脂质体薄膜,在不需要制备纳米级和微米级混合超声造影剂或者添加表面活性剂的条件下,直接制作出纯的粒径均一的纳米级超声造影剂。SEM和荧光显微镜观测结果与DLS相近。纳米气泡展现出较好的稳定性,并且没有明显的细胞毒性。纳泡在体外可以达到与声诺维相同的成像效果,而体内成像持续时间比声诺维更长。病理CLSM结果显示纳泡可以透过血管进入肿瘤组织细胞间隙。
【关键词】：纳米气泡 脂质体 分子影像 超声造影剂 肿瘤成像
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-23
• 1、肿瘤靶向与 EPR 效应15-16
• 2、分子影像16-19
• 3、超声分子影像19-23
• 第一部分 纳米气泡的制备及理化性质的检测23-35
• 0 引言23-24
• 1 材料和设备24-25
• 2 实验方法25-31
• 3 结果31-32
• 4 讨论32-35
• 第二部分 纳米气泡体内、外成像效果及肿瘤的被动靶向35-51
• 0 引言35-36
• 1 材料和设备36-37
• 2 实验方法37-40
• 3 结果40-41
• 4 讨论41-51
• 小结51-53
• 参考文献53-66
• 个人简历和研究成果66-68
• 致谢68

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本文编号：1012344