催吐萝芙木生物碱的提取工艺与表面等离子共振技术在槲寄生凝集素的应用

发布时间：2014-12-03 15:19

【摘要】 本论文由两部分独立的研究内容组成：第一部分研究催吐萝芙木中生物碱的分离提取工艺、结构测定和药效学性质，第二部分研究基于表面等离子共振技术平台的传感芯片再生制备技术以及槲寄生凝集素含量检测。下面分别就这两部分内容进行阐述。第一部分：催吐萝芙木生物碱的提取工艺研究催吐萝芙木是20世纪60年代自非洲加纳引种至我国云南、广西等地区的天然药材植物。催吐萝芙木的根部富含利血平、育亨宾等吲哚类生物碱，业已成为医药工业的重要原料。本课题在这样的背景下，开发了催吐萝芙木的新型分离提取工艺，采用本课题组自行设计装配的制备型反相层析装置，提取其中的生物碱成分，测定了10种生物碱成分的化学结构，并初步考察了其中4种成分的降血压活性与急性毒性。本部分共分为三章。第一章概述了萝芙木属植物所含药用生物碱的研究现状和催吐萝芙木药用生物碱分离提取工艺的现状以及课题的意义与主要内容。第二章建立了以酸性乙醇浸提、大孔树脂吸附、大孔弱酸性阳离子交换树脂提取、C18反相层析相结合，在实验室规模从催吐萝芙木中提取生物碱的新型工艺。第三章采用超高效液相色谱-质谱以及核磁共振等方法对从催吐萝芙木中获得的生物碱的化学结构进行测定，共鉴定了10种生物碱的化学结构。通过肾动脉结扎方法制作SD大鼠高血压模型，考察了从催吐萝芙木中分离提取出的4种组分的降血压活性，用ICR小鼠测定了这些组分的急性毒性。第一部分工作的创新点主要有：（1）自行设计和装配了制备型C18反相层析装置，具有处理量大、回收率高、操作简单等特点。试验表明，该装置在天然产物的分离纯化方面显示出广泛的适用性，有望通过进一步深入开发进入工业化生产领域。（2）本课题所建立的高产率的综合提取工艺，可以同时分离纯化10种不同的生物碱成分，所获得的生物碱成分的收率、纯度比传统的工艺更高。（3）本课题开发设计的提取工艺中所使用的有机溶剂乙醇等均可再回收利用，比起现有分离提取方法，所使用的有机溶剂更少，对环境污染更低。第二部分：表面等离子共振（SPR）技术在槲寄生凝集素的应用槲寄生凝集素是免疫调节的重要蛋白，近年来逐渐成为国内外生物医药学的研究热点。作为新兴的生物传感技术，SPR技术具有高灵敏度、高精确性的特点。本论文基于Plasmonic的SPR传感器的平台，探索了通过化学偶联的方法制备4种不同类型的传感芯片的技术，建立了一种操作简单、节约时间和试剂的快速检测槲寄生凝集素含量的方法；利用SPR技术考察了槲寄生凝集素对两株细胞系A549和Calu-3的体外细胞毒作用。本部分共分为三章。第四章介绍了SPR传感器的基本原理与本课题所使用的Plasmonic的SPR传感器的构造与操作方法，并阐述了槲寄生凝集素目前的研究现状以及课题的意义与主要内容。第五章设计了通过化学偶联的方法制备4种不同类型的传感芯片的方法，进一步扩大了SPR传感器在生物领域的应用范围。建立了针对I型槲寄生凝集素（ML-I）样品的三明治型抗体反应体系测定方法，并可分别用于缓冲液、血清样品及市售针剂中ML-I含量的检测，具有用于医学检验以及药厂质量控制的潜在应用价值。第六章基于SPR技术平台，以两株细胞系A549和Calu-3为研究对象，初步考察了ML-I对其体外毒性作用。第二部分工作的创新点主要有：（1）设计、改良了基于Plasmonic传感器技术平台的不同类型的传感芯片制备再生方法，具有程序简单、操作方便的特点。（2）首次报道使用SPR传感器测定槲寄生凝集素样品含量的方法，具有新颖性强、试剂用量少、节约时间的特点，且重复性好。 

第一部分：催吐萝芙木生物碱的提取工艺研究

第一章绪论
1.1萝芙木属药用生物碱的研究现状
萝芙木（Rauvolfia）系夹竹桃科萝芙木属的常绿小灌木，广泛分布于热带及亚热带地区。其属名是为了纪念德国植物学家LeonhardRauwolf而得名，目前广泛使用的中文名称为其属名的音译。
在我国，萝芙木属植物是非常重要的传统中药材资源，其清热、降压、宁神的药用价值很早就被民间发现，并被用于治疗感冒发热、头痛身疼、眩晕、失眠、跌打损伤等疾病[1]。
1931年，印度化学家Siddiqui等首次对萝芙木属植物的化学成分进行了研究，从蛇根木中分离并鉴定了不同的生物碱[2]。此后，越来越多的生物碱类化合物从萝芙木中获得。研究表明，萝芙木主要含有利血平（reserpine）、育亨宾（yohimbine）、阿吗灵（ajmaline，即萝芙木碱rauwolfine）、阿吗立新（ajmalicine）、利新胺（rescinnamine）、坎尼生（canescine）、罗尼生（raunescine）、蛇根碱（serpentine）、蛇根亭宁（serpentitine）等吲哚类生物碱[3~5]。其中，利血平、育亨宾、阿吗灵的研究起步较早，研究深度与广度也较突出；而其他的生物碱的研究亦在逐渐拓展。
1.1.1利血平的研究
利血平（reserpine）是萝芙木中主要的药用生物碱，在催吐萝芙木中含量最高可达1%。有轻度降压功能，作用缓慢而持久，对中枢神经系统有镇静、安定作用，主要用于轻重度高血压的治疗[6]。
.........................................

1.2催吐萝芙木药用生物碱的提取工艺研究
催吐萝芙木（RauvolfiavomitoriaAfzel）原产于非洲加纳，1960年代引种至我国的云南、广西等地，近年来获得大面积的引栽种植[42]。
目前关于催吐萝芙木的生物碱的提取工艺研究报道，一部分关注生物总碱的提取，所获得的产物含有利血平、萝芙木甲素等生物碱，其成分即为萝芙木根部的弱碱性混合生物碱[43~45]；还有一部分报道的工艺只注重其中一种生物碱的提取，如利血平的提取，催吐萝芙木的原料资源未能得到充分的利用[46~48]；此外还有一部分报道的研究目的在于分析而不是制备，操作步骤较繁琐，收率低，不适合生产[49~51]。
本课题组多年来一直致力于萝芙木属植物的生物碱资源利用方面的研究[48、52]，在传统提取工艺的基础上进行了创新改进，开发了新型利血平分离提取工艺，分别取得小试、中试规模实验的成功。此外，在现有的利血平提取工艺的基础上，研究从同一批催吐萝芙木原料中提取利血平和育亨宾的新工艺，并取得了阶段性的实验成果，已经成为规模化工业生产的重要参考依据，有望通过进一步的科技成果转化，实现经济效益的产出。

第二章催吐萝芙木有效成分的分离提取

引言：
本课题的研究目标为建立从催吐萝芙木中同时获得利血平、蛇根碱、阿吗灵等生物碱单体的分离提取工艺，并为实现大规模工业生产提供必要的参考依据。在已建立的利血平、育亨宾提取工艺的基础上[1~3]，我们认为酸性乙醇浸提、大孔树脂吸附和洗脱步骤已经成为提取分离生物碱类化合物的有效步骤。但是，在获得含有生物碱组分的洗脱液之后，如何进一步提纯，获得纯净的生物碱化合物单体，是整个催吐萝芙木生物碱提取工艺中的最关键步骤，也是本课题研究中创新性最高的技术环节。
通过本课题的前期研究工作，我们发现溶剂萃取、薄层层析、硅胶柱层析等常用的分离纯化天然产物有效成分的方法在此并不适用[4~6]。在本课题的研究中，由于从催吐萝芙木中浸提出的生物碱组分过于复杂，增加了阳离子交换树脂处理的步骤，对所获得的含有生物碱组分的大孔树脂洗脱液进行分离纯化。此外，我们还考察了电层析和反相层析这两种分离方法的纯化效果。实验结果表明，以羧甲基纤维素作为分离介质，加载生物碱粗提样品，通电进行电层析的过程中，液体在层析柱中流速较慢，且产生的焦耳热过大，易破坏分解样品，分离效果不明显。而反相层析的方法，却获得了较为理想的分离结果。由此，在阳离子交换树脂处理步骤后，直接以C18柱反相层析提取，通过梯度洗脱，分段收集洗脱液，将生物碱组分分离，然后通过有机溶剂结晶的方法，获得纯净的生物碱单体。
.....................................

2.1材料与仪器
2.1.1材料
干燥的催吐萝芙木根块，由云南思茅伟农植物制药有限公司提供。育亨宾粗品，由陕西禾博天然产物有限公司提供。利血平和育亨宾标准品均购自美国sigma-aldrich公司。高效液相色谱用甲醇为色谱纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司。工业乙醇，购自常熟市杨园化工有限公司。氢氧化钠、硫酸、丙酮、无水乙醇、甲醇、三氟乙酸，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
HZ-818大孔吸附树脂，购自华东理工大学华震科技有限公司。D152大孔弱酸性阳离子交换树脂，购自南开大学化工厂。1×2型强酸性阳离子交换树脂，上海医药工业研究院提供。
.....................................

第二部分：表面等离子共振技术在槲寄生凝集素的应用.............92-145
第四章绪论.............................92-109
4.1表面等离子共振技术概述.........................92-95
4.1.1表面等离子共振技术的基本原理..................92-93
4.1.2表面等离子共振技术的实验方法.......................93-94
4.1.3表面等离子共振技术的特点..................94-95
4.2Plasmonic表面等离子共振传感器...............95-101
4.2.1样品池.....................96
4.2.2自动进样系统....................96-98
4.2.3光学检测系统...........................98-100
4.2.4其他重要技术参数....................100-101
4.3槲寄生凝集素的研究现状................101-103
4.3.1槲寄生类植物的药用成分................101-102
4.3.2槲寄生凝集素的类型....................102-103
4.4课题意义...........................103-104
4.5课题的主要工作....................104
参考文献..................................104-109
第五章表面等离子共振技术在槲寄生凝集素检测中的应用........109-133
引言.............................109
5.1材料与仪器...............109-110
5.2实验方法.........................110-115
5.2.1传感芯片的制备........................110-114
5.2.2传感芯片的选择...................114
5.2.3ML-I样品的测定...................114-115
5.2.4市售针剂样品的测定........................115
5.3实验结果与讨论.......................115-129
5.3.1传感芯片的制备..............115-117
5.3.2传感芯片的选择.....................117-121
5.3.3抗体反应体系的确定............................121-122
5.3.4磷酸盐缓冲液体系中ML-I样品的测定..............122-125
5.3.5血清体系中ML-I样品的测定..............125-128
5.3.6市售针剂中ML-I样品的测定......................128-129
5.4本章小结..........................129
参考文献.............................129-133

第六章基于表面等离子共振技术的槲寄生凝集素的体外细胞毒作用考察

引言：
近年来，基于SPR技术的活体细胞研究工作不断深入。根据SPR生物传感器与细胞间反应的原理可知，当细胞本身受到外部刺激的影响而导致活性的变化时，通常细胞形态也会发生相应的变化，因此使细胞膜与SPR生物传感器的Au膜之间的折射率发生变化，宏观上则体现在SPR检测信号的变化[1、2]。
在这一前提下，Chabot等[3]以人胚肾（HumanEmbryonicKindey）HEK293细胞系为研究对象，使用SPR生物传感器评估了细胞3种类型外部因子内毒素（脂多糖）、化学毒素（叠氮化钠）和生理激动剂（凝血酶）刺激下的反应。由相差显微镜的镜检结果与SPR检测信号结果比较后发现，经内毒素处理的细胞发生死亡，导致SPR检测信号剧烈变化；经叠氮化钠处理的细胞体收缩，也导致了SPR检测信号的变化；凝血酶诱导的细胞反应显示出了测量激光反射率的迅速下降，5min后又恢复至原始值。Yanase等[4]观察后发现，当大鼠嗜碱性白血病细胞（ratbasophilicleukemiacells，RBL-2H3）在传感芯片的表面培养并予以刺激时，可以检测到SPR传感器的反射角度（angleofresonance,AR）的变化；同样，在表皮生长因子（epidermalgrowthfactor,EGF）的刺激下，小鼠角质形成细胞PAM212的AR值也发生了变化。而导致这些变化的原因在于细胞内的反应，并通过共焦显微镜的观察，证实了细胞黏附区域的变化。
在本章实验中，采用了Plasmonic公司制造的表面等离子共振器，以两株细胞系A549和Calu-3为研究对象，初步考察了I型槲寄生凝集素（ML-I）对其体外毒性作用。
..........................................

结论

1．建立了酸性乙醇浸提、HZ-818大孔树脂吸附、D152弱酸性阳离子交换树脂纯化、C18反相层析、结晶的提取工艺路线，从催吐萝芙木中分离提取出10种生物碱成分，其中阿吗灵、蛇根亭酸、蛇根碱、利血平、利新胺的纯度较高，回收率高。
2．通过自行构建肾动脉结扎高血压SD大鼠模型，对催吐萝芙木中分离提取出的4种成分的降血压活性进行了考察：有机酸类物质的降血压作用不明显；阿吗灵和蛇根亭酸具有稳定的降血压作用；蛇根碱也有降血压作用，但作用较弱。阿吗灵的LD50为800mg/kg，有轻度毒性；所实验的其余几种化合物的急性毒性都很小。
3．设计了用SPR传感器测定I型槲寄生凝集素（ML-I）样品的三明治型抗体反应体系方法，并可分别用于缓冲液、血清样品及市售针剂体系中ML-I含量的检测，具有用于医学检验以及药厂的质量控制的潜在应用价值。
...............................
参考文献：

[1] 陶蕾,赵明珠,赵凤生,徐伟,王芝祥.  离子交换-反相色谱纯化育亨宾[J]. 中国生化药物杂志. 2011(05)
[2] 姜华,陈蓉蓉,崔淑歌,蒲含林.  萝芙木根中萝芙木碱的分离纯化[J]. 广州化学. 2011(01)
[3] 王倩,张翼,陆敏北京大学基础医学院病理学系,管又飞,朱毅,王悦.  高盐诱导的高血压大鼠模型肾组织可溶性表氧化物酶高表达及其作用初步探讨[J]. 北京大学学报(医学版). 2010(02)
[4] 许敬亮,袁振宏,张宇,庄新姝,徐惠娟,梁翠谊,马隆龙.  氨基功能载体固定化酶研究进展[J]. 化工进展. 2010(03)
[5] 孙华,魏美娟,许均,钱柳,胡朝英,黄秋愉,程伟志,余奇文,张继英,张冬青,陈雪华.  槲寄生凝集素蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究[J]. 中国微循环. 2009(06)
[6] 刘洋洋,汪春牛,许琼情,李晓亮,刘平怀.  萝芙木属植物吲哚生物碱成分研究进展[J]. 海南师范大学学报(自然科学版). 2009(04)
[7] 李松梅,周思卓,刘建华.  铝合金表面原位自组装超疏水膜层的制备及耐蚀性能[J]. 物理化学学报. 2009(12)
[8] 刘平怀,刘洋洋,时杰,刘奇.  加速溶剂萃取(ASE)技术提取海南萝芙木活性成分[J]. 精细化工. 2009(11)
[9] 卫小红,马爱群,邵杰,王军辉,孟君会.  齐墩果酸对人肺腺癌细胞A549增殖与细胞周期的阻滞作用[J]. 第四军医大学学报. 2009(18)
[10] 刘洋洋,梁振益,刘平怀.  混合溶剂提取催吐萝芙木水溶性生物碱的工艺研究[J]. 精细化工中间体. 2009(03)


本文编号：10217