硫黄熏蒸对白芷化学成分、药效和安全性影响的研究

发布时间：2014-12-08 10:23

【摘要】 自芷来源为伞形科植物白芷Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f.或杭白芷Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var. formosana (Boiss) Shan et Yuan的干燥根,是一味常用中药。白芷主产于我国四川、河北、安徽、河南等省,一直以来,白芷的产地加工是一个突出的生产难题。白芷采收后若不及时干燥,极易腐烂变质,目前全国各地的白芷产地加工均采用硫黄熏蒸。硫黄熏蒸虽对不易干燥或易发霉、变质、生虫的中药材具有杀菌防腐、漂白、增加色泽美感等作用,但大量研究表明,熏硫造成中药材性味劣变,生物活性组分损失及有害物质残留,硫黄熏蒸对药材质量带来的负面影响己引起人们的高度关注。本文针对硫黄熏蒸前后及不同熏硫程度对白芷药材化学成分、药效和安全性的影响,二氧化硫残留量的变化规律及熏硫加工的规范化问题,在前期研究的基础上,运用多学科的技术方法,通过系统深入的研究,为白芷硫黄熏蒸加工方法的合理性、规范化及制定科学合理、客观可控的有效成分和外源性有害物质二氧化硫残留量的限量标准提供科学依据。研究结果如下：1.不同熏硫程度白芷的加工及药材外观性状对比分析。根据前期白芷主产区调研,进行了不同硫黄用量、不同熏蒸时间的加工试验,用产区传统搭灶的方式共制备不同熏硫程度白芷样品21个,为本文研究的顺利进行提供了保障。通过对不同熏硫程度白芷外观性状的对比观察,发现熏硫与未熏硫白芷的主要区别在颜色、断面特征、气味等方面。硫黄熏蒸后的白芷表面颜色稍浅,断面类白色,粉性较强,形成层环和油点不甚明显,略带酸味,但不同熏硫程度的白芷上述特征存在一定差异,随着硫黄用量和熏蒸时间的增加,断面颜色逐渐变白,形成层环及棕色油点等特征逐渐消失。硫黄熏蒸对白芷的外观性状产生了一定的影响。从白芷的外观性状上,可以直观的判断白芷是否熏硫以及估计其硫黄熏蒸的程度。2.首次进行了不同熏硫程度白芷二氧化硫残留量的动态检测按照《中国药典》2010版附录项下的方法对不同熏硫程度白芷的二氧化硫残留量进行了动态检测。硫黄熏蒸过的样品二氧化硫残留量是自然晒干的样品的几百甚至上千倍,硫黄用量为25g、100g、200g/10kg药材和熏蒸时间为18h的样品其二氧化硫残留量符合国家规定的150mg/kg的限量标准。本研究为白芷硫黄熏蒸加工中熏硫程度的确定提供了参考依据。硫黄用量和硫黄熏蒸时间与二氧化硫残留量虽未呈现出良好的线性关系,但从总体上,随着硫黄用量的增加和熏蒸时间的延长,二氧化硫残留量也有所增加。3.对不同熏硫程度白芷的化学成分进行了系统的对比分析在薄层色谱鉴别方面,确立以氯仿-乙酸乙酯(10：1)和环己烷-氯仿-乙醚(4：1：2)进行二次展开的色谱条件,对22批不同程度硫黄熏蒸白芷及未熏硫白芷样品进行薄层色谱对比。氧化前胡素是白芷熏硫与否的一个指标性成分,从薄层色谱图上可较为直观的鉴别白芷是否熏硫。在高效液相指纹图谱分析方面,建立22批不同程度硫黄熏蒸白芷HPLC指纹图谱,校正后得到的对照色谱中19个共有峰,其中确认了11个化合物。由于硫黄熏蒸程度的不同,在共有峰的峰面积上有差异。对比熏硫与未熏硫白芷的图谱,发现两者在色谱峰数量及峰面积上有差异。通过统计分析,未熏硫白芷与熏硫白芷聚为两类,主成分分析综合评分熏硫白芷得分较低,质量较差。从HPLC指纹图谱上也能直观的判断出白芷熏硫与否。首次进行不同熏硫程度白芷LC-MS分析,建立不同熏硫程度白芷的药材、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的LC-MS分析方法,得到白芷香豆素类化合物不同的变化规律。三个不同的极性部位,硫黄熏蒸对石油醚、乙酸乙酯部位的影响与对药材的影响类似,对正丁醇部位的影响较大,新增加的峰多而明显。首次进行不同程度硫黄熏蒸白芷GC-MS分析,在前期的研究基础上,建立了不同程度硫黄熏蒸白芷挥发油的GC-MS分析方法。不同程度硫黄熏蒸白芷的挥发油中共鉴定出67种化合物。其中有4种共有成分,分别为：2,6-二叔丁基对甲基苯酚,棕榈酸乙酯,亚油酸乙酯,十六碳烷基十四烷酸酯。随着硫黄熏蒸程度的不同,白芷中挥发油的种类也发生了变化,产生了很多新的化合物,四个共有成分变化不一。对不同熏硫程度白芷的浸出物和指标性成分进行含量测定,随着硫黄用量和熏蒸时间的增加,,白芷的浸出物含量比未熏硫白芷下降28.5%-47.3%,氧化前胡素和欧前胡素的含量总体呈下降趋势。自然晒干样品的浸出物、氧化前胡素、欧前胡素含量明显高于其他经过硫黄熏蒸的样品。4首次对熏硫与未熏硫白芷的进行体内血浆的HPLC图谱进行对比研究通过采血时间、采血部位、给药剂量等方面的考察,建立了白芷血浆HPLC分析方法,对比了熏硫与未熏硫白芷体内血浆的HPLC图谱。未熏硫白芷给药后的血浆HPLC图谱中出现了12个色谱峰,其中有2个峰可能是代谢产生的峰。熏硫白芷入血成分较未熏硫白芷少,入血成分峰面积、总峰面积较低,并且尚未出现代谢产生的峰。本研究为白芷药效物质基础的研究奠定了基础。5.首次采用药效学结合血浆药物化学的方法对熏硫与未熏硫白芷进行药效评价分别采用经典的二甲苯致小鼠耳肿胀和醋酸致小鼠扭体法对硫黄熏蒸前后白芷进行抗炎、镇痛的实验。在药效学指标上未熏硫白芷高剂量表现出显著的抗炎、镇痛作用,而熏硫白芷部分剂量组显示出抗炎镇痛作用,但无统计学意义。各个剂量组的血浆成分类似但也有所不同。随着给药剂量的减小,各剂量组入血成分的峰面积也相应减小。推测水合氧化前胡内酯可能是白芷镇痛、抗炎的药效物质基础,为阐明白芷的谱效关系奠定了基础。6进行了熏硫与未熏硫白芷急性毒性试验通过对熏硫与未熏硫白芷的急性毒性试验,以评价其安全性。结果表明,单次灌胃给药未熏硫白芷LD50为52.41g生药/kg,即约相当于临床用量的353倍;单次灌胃给予硫黄熏蒸白芷的最大耐受量为123.6g生药/kg,即约相当于临床用量的832倍。虽然两者均在安全使用的范围,可以安全使用,但是未熏硫白芷的毒性明显比硫黄熏蒸白芷的毒性大。7首次进行了不同熏硫程度白芷化学成分、药效及安全性的相关性分析用曲线回归的方法探讨了二氧化硫残留量分别与氧化前胡素、欧前胡素的关系,建立了二者的模型方程,相关性良好。氧化前胡素与二氧化硫残留量二者呈对数相关为Y=0.085-0.0111nX；欧前胡素与二氧化硫残留量二者呈三次方相关,关系式为Y=0.176+3.150×10-7X2-1.666×10-10X3。探讨了白芷抗炎、镇痛的谱效关系,用经典的二甲苯致小鼠耳肿胀法、醋酸致小鼠扭体法评价熏硫与未熏硫的白芷得到的药效数据,与各剂量组的血浆HPLC指纹图谱色谱峰峰面积进行多元相关分析。将各剂量组的色谱峰峰面积进行主成分分析,求得各组的综合评分后,用综合评分C作为自变量,药效学指标作为因变量Y做曲线回归,预测二者的关系,建立相关方程。综合抗炎、镇痛两个药理谱效关系结果,血浆主成分分析的综合评分与抗炎、镇痛的药效学指标呈正相关。根据熏硫与未熏硫白芷急性毒性结果,结合白芷体外、体内化学成分分析,推断引起白芷毒性的可能是与有效成分相关的内源性物质,至于是白芷中的原型成分还是代谢产物引起的毒性还需要进一步的研究。虽然熏硫白芷的毒性较未熏硫白芷低,但外源性有害物质二氧化硫残留量明显增加,影响用药的安全性,故应规范白芷硫黄熏蒸的加工方法。8通过本文研究,为阐明白芷硫黄熏蒸加7-方法的合理性、确定合适的熏硫程度以及制定科学合理、客观可控的有效成分及二氧化硫限量标准提供了科学依据研究发现,白芷熏硫后虽然影响有效成分和药效,且二氧化硫残留量增加,但便于干燥、贮藏,成本低,现阶段在白芷产区有一定的实用价值,只要控制好熏硫程度,能够保证白芷药材质量及临床用药的安全有效。根据硫黄熏蒸对白芷化学成分、药效及安全性影响的研究及相关性分析,初步建议,白芷硫黄熏蒸加工的硫黄用量不超过100g/10kg,熏蒸时间不超过8h;含量测定以欧前胡素、氧化前胡素为指标,前者不得低于0.14%、后者不得低于0.09%;二氧化硫残留量不得过400mg/kg。 

前言

1立题依据
中药质量的优劣直接干系到中医临床用药的宁静有用，中药怎样被天下所认同和担当，己经成为中医药财产面对的紧张课题。然而影响中药质量的因素许多，就中药材而言，包罗了生产、加工!e藏及流畅等全历程。此中产地加工是影响中药材质量的紧张因素。g上世纪60年月研究出熏硫防烂技能后，被广泛运用于多种中药材的产地加工。1963年版《中国药典》牛膝项下初次收载此要领，现在在中药材产地加工中接纳硫黄熏蒸是极为广泛的征象，如人参、泰西参、薏孩仁、山药、百合、贝母、枸紀、黄苗、梧梗、白苟、菊花、金银花、党参、当归、黄蔑、莲子、玉竹、银耳等均存在熏硫题目。硫黄熏蒸虽对不易干燥或易发霉、变质、生虫的中药材具有杀菌防腐、漂白、增长光彩美感等作用，但大量研究评释，熏硫造成中药材性味劣变，生物活性组分丧失及有害物质残留，硫黄熏蒸对药材质量带来的负面影响己引起人们的高度存眷。比年来，关于中药材硫黄熏蒸对其质量影响的研究报道较多，大多数药材熏蒸后有用身分含量低落乃至有些还孕育发生了新的化学身分⑴、药效降落、耽误有用身分在体内的吸取[2]。从2005年版《中国药典》起取消了全部中药材品种的熏硫产地加工要领，然而硫黄熏蒸又是我国药农传统惯用的产地加工要领，其应用汗青较长，现在尚无轻便易行和经济有用的要领替换，现实生产中还无法完全取缔。为防备其加工历程中滥用大概过分利用硫黄熏蒸的题目，国度药典委员会2011年6月14日公布有关中药材控制二氧化硫残留量检测限度的公示，对《中国药典》收载的山药、牛膝、粉葛、甘遂、天冬、天麻、天花粉、白及、白苟、白术、党参等11味药材及其饮片项下增长了 “二氧化硫残留量”查抄，限度为尺度为400mg/kg,在《中国药典》药材和饮片检定通则中增长了 “除尚有划定外，中药材及饮片二氧化硫残留量不得凌驾150mg/kg”的划定，这评释对有些药材品种容许有控制的釆用熏硫加工。
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2研究总体思路
在前期白相关研究的基础上，釆用中药学、中药化学、分析化学、药理学、毒理学及血清药物化学等多学科的技术和方法，深入研宄硫黄熏蒸前后及不同熏硫程度白花化学物质基础的变化规律及对药效和安全性的影响，探索三者之间的相关性，阐明化学物质基础的量-效-毒关系，为规范白足熏硫加工方法、从加工环节控制白定药材的质量及制定科学合理、客观可控的有效成分和外源性有害物质二氧化硫残留量的限量标准提供理论依据。
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第一章不同熏硫程度白正药材的加工及外观性状分析

1不同熏硫程度白正药材的加工试验
根据文献及前期研究基础，进行不同硫黄用量及不同熏蒸时间的加工试验，制备不同熏硫程度白定药材样品。
1. 1实验材料
本研究白主样品均于2011年7月釆自白正GAP基地，经马逾英教授鉴定为杭白^￡ Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f_ vanformosana (Boiss) Shan et Yuan 的干燥根。
硫黄购自遂宁市中脊村供销社（西南有机田分公司川中有机矿磨机天然气净化厂出品长征牌硫横，标准：GB/T2449-2006，许可证：XK13-203-0060)。
1. 2实验方法
据前期白:主产区调研，各地熏硫加工白定没有统一的标准，硫黄用量及熏硫时间各有不同。我们在前期研究的基础上对不同熏硫程度的白正样品进行加工实验。
选择同一等级、大小一致的鲜白 lOkg,按白;；￡产区熏硫加工的传统方法搭灶，硫黄用量分别为 25g、50g、lOOg、150g、200g、300g、500g、750g,熏蒸24小时，取中层混勾，随机抽取3kg,编号，晒干，备用。
选择同一等级、大小一致的鲜白:10kg.按白庄产区熏硫加工的传统方法搭灶，硫黄用量150g (即每1000kg生药使用硫黄15kg),分别熏蒸2h、4h、6h> 8h、lOh、12h、18h、24h、36h、48h,取中层混勾，随机抽取 3kg，编号，晒干，备用。
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2不同熏硫程度白正药材性状对比分析
观察记录不同熏硫程度白]^药材的断面、气味等性状特征，并拍照，结果见表2，附图2。
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第二章 不同熏硫程度白芷二氧化硫残留量的动态分析 ..............20-24 
1 仪器与试剂............................ 20 
2 实验方法.................... 20-21 
3 结果与分析 ................21-23 
4 小结与讨论 ..............................23-24 
第三章 不同熏硫程度白芷化学成分变化的研究 ...........24-64 
1 仪器与试剂............................ 24 
2 不同熏硫程度白芷薄层色谱鉴别.................. 24-25 
3 不同熏硫程度白芷高效液相色谱指纹图谱的研究.......... 25-40 
4 不同硫黄熏硫程度白芷LC-MS图谱研究 ......................40-51 
5 不同熏硫程度白芷挥发油GC-MS分析................... 51-56 
6 不同熏硫程度白芷浸出物测定.................. 56-58 
7 不同熏硫程度白芷的含量测定研究 ......................58-61 
8 小结与讨论 .....................................61-64 
第四章 熏硫与未熏硫白芷的血浆HPLC图谱的研究.............. 64-71 
1 仪器与试剂 ..........................64 
2 实验动物..................... 64 
3 受试药物制备方法...................... 64
4 采血时间的筛选 ...................64-65 
5 采血部位的筛选 ....................65-66 
6 给药剂量的筛选 ..........................66-67 
7 熏硫与未熏硫白芷血浆HPLC图谱的对比................. 67-69 
8 小结与讨论 .............................69-71 
第五章 熏硫与未熏硫白芷的药效学评价研究................. 71-80 

第七章 相关性分析

前面六章已经分别从硫黄熏蒸对白正药材化学成分、药效及安全性这三个方面的影响进行了分析，为寻找之间的相关性，本章主要运用多元相关、趋势预测、曲线回归等统计学方法对不同熏硫程度白;二氧化硫残留量与化学成分的关系，熏硫与未熏硫白芷药效作用与化学成分的关系以及熏硫与未熏硫白立化学成分与安全性的相关性进行分析，为白足硫黄熏蒸加工的合理性及规范化提供科学依据。
1不同熏硫程度白定二氧化硫残留量与化学成分的关系
以二氧化硫残留量（mg/kg)为横坐标、氧化前胡素（％)为纵坐标做散点图，并做趋势预测分析。用SPSS19.0软件做曲线回归，结果见表32、图52。
由图52可知,不同熏硫程度白花中氧化前胡素的含量随着二筑化硫残留量增高而减少。
相关因子R2越接近1,表示回归平方和在总平方和中所占的比重越大，回归效果越好。如表32所示，对数模型的相关因子R2 = 0.970，相关性较高。根据Logarithmic (对数模型，Y=bo+b,lnX),用Y表示氧化前胡素含量（％) X100,用X表示二氧化硫残留量（mg/kg)得到二者之间的相关关系为：Y=0.085-0.011丨nX。
以二氧化硫残留量（mg/kg)为横坐标、欧前胡素（％)为纵坐标做散点图，并做趋势预测分析。用SPSS19.0软件做曲线回归，结果见表32、图53。
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结论

研宄发现，白正熏硫后虽然影响有效成分和药效，且二氧化硫残留量增加，但便于干燥，成本低，现阶段在白庄产区有一定的实用价值，只要控制好熏硫程度，能够保证白花药材质量及临床用药的安全有效。根据硫黄熏蒸对化学成分、药效及安全性影响的研究及相关性分析，初步建议，白;硫黄熏蒸加工的硫黄用量不超过loog/iokg,熏蒸时间不超过8h;含量测定以欧前胡素、氧化前胡素为指标，前者不得低于0.14%、后者不得低于0.09%; 二氧化硫残留量不得过400mg/kg。
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本文编号：10248