基于主成分分析的胶类药材质量控制关键技术研究

【摘要】 胶类药材是我国中药宝库中一类特殊的动物药,是由动物的皮、骨骼等经特殊工艺加工而成,常见的有阿胶、鹿角胶、龟甲胶及其相关中成药制剂,如复方阿胶浆、龟鹿二仙膏等。近年来,由于动物胶类药材的生产原料短缺,价格昂贵,部分生产企业为降低成本,用杂皮胶投料违法生产的情况比较严重,同时在高价胶类药材(龟甲胶及鹿角胶)生产过程中掺加低价胶类(阿胶或明胶)药材非法谋利的情况屡见不鲜,导致胶类药材的质量参差不齐、市场秩序非常混乱。然而,由于目前胶类药材的质量标准整体水平较低,长期缺乏专属性鉴别方法和高灵敏度的检测技术,面对以上质量问题,药品检验和监管部门往往束手无策。因此,建立准确性好、灵敏度高、专属性强的动物胶类药材的质量控制技术和方法,并应用于相关药品的质量控制标准中,必将极大推进我国胶类药品质量监管的科学性与有效性,对保障公众用药安全有效、维护市场公平公正以及保护消费者利益等方面产生深远的影响。本学位论文依据不同动物因物种差异,其胶原蛋白氨基酸序列必然存在一定的差异这一原理,采用液质联用多肽识别技术和数据处理软件对蛋白质酶解后的胶类样品(主含多肽混合物)进行分析处理,寻找并发现各胶类样品的特征肽段,同时借用近年来蛋白质及多肽序列研究的技术方法和成果,从分子层次研究各胶类药材的主体组分性质及具有专属性鉴别意义的特征多肽成分,从而建立基于胶原蛋白序列差异的胶类药材真伪鉴别方法。以期从根本上为胶类药材的质量控制和评价提供技术依据。论文围绕以上思路主要开展了以下几个方面的研究工作,并取得了一些创新性结果：一、采用蛋白质酶切技术和液质联用多肽识别技术对胶类药材进行研究。选择胰蛋白酶对鹿角胶、龟甲胶、阿胶、黄明胶、新阿胶的胶原蛋白进行酶解,得到酶解肽,进而采用液质联用多肽识别技术,建立5种胶类药材酶解肽图。并结合MakerLnyx软件,进行主成分分析和因子分析,找出了鹿角胶2个特征离子,龟甲胶3个特征离子,阿胶4个特征离子,黄明胶4个特征离子,新阿胶4个特征离子。进一步对各胶类特征离子的二级图谱的分析,结合MASCOT检索,鉴定了鹿角胶1个特征离子的序列,龟甲胶3个特征离子的序列,阿胶4个特征离子的序列,黄明胶4个特征离子的序列,新阿胶3个特征离子的序列。并按解析出的序列,进行化学合成,验证了部分序列的正确性。二、以鹿角胶的特征肽m/z732.8. m/z765.4,龟甲胶的特征肽m/z745.8, m/z631.3, m/z758.4,阿胶的特征肽m/z765.9, m/z618.8, m/z539.8,黄明胶的特征肽m/z641.3、m/z790.9, m/z604.8,及新阿胶的特征肽m/z925.4, m/z774.3.m/z739.8作为母离子,采用高效液相色谱-质谱联用技术,建立了各种胶类的特征图谱和质谱信息库,继而形成了胶类药材真伪鉴定和快速筛查智能检测技术平台。三、以标准化方法建立为目标,本研究开展了检测用标准物质的研制工作,首次研制标定出鹿角胶、龟甲胶、黄明胶对照药材和牛皮特征肽A对照品。并采用高效液相色谱-串联四级杆质谱联用技术,以鹿角胶、龟甲胶、阿胶、黄明胶对照药材和牛皮特征肽A为对照,建立了鹿角胶、龟甲胶、阿胶的定性鉴别方法和用于打击违法使用杂皮投料生产龟甲胶、鹿角胶、阿胶的补充检验方法。四、以胶原蛋白中的特殊氨基酸—羟脯氨酸为主要指标,建立了异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化-高效液相色谱法同时测定胶类药材中4种主要氨基酸(羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸)的含量测定方法,并进行了方法学的验证,提出了阿胶中4种主要氨基酸含量测定标准草案。本论文的特色与创新之处：(1)首次通过酶切技术及高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS/MS)技术,确定各不同胶类药材的专属性特征肽段,并通过氨基酸序列分析和特征肽段的化学合成等手段,验证了特征肽段序列的正确性；(2)首次将肽图分析和数学统计分析方法应用于胶类药材的真伪鉴定。通过各种胶类药材样品的色谱质谱信息库(色谱参数、质谱参数、特征肽段信息等)的建立和应用,首次建立胶类药材真伪识别专家系统；(3)首次建立了分析检测用标准物质及鹿角胶、龟甲胶、阿胶专属性强的胶类药材定性鉴别标准方法；(4)首次建立正品胶类药材中掺加杂皮的检测方法,并申报国家补充检验方法标准。

前言

胶类药材是特殊的动物药，常见的有阿胶、龟甲胶及其相关中成药制制，如复方阿胶浆、龟鹿二仙膏等。分生产企业并非用真正龟甲、鹿角，驴皮，而是以杂皮如牛皮投料。更有甚者，以腐烂变质的杂皮或工业皮革下脚料投料生产。严重影响了药品市场秩序及广大人民群众的饮食用药安全。央视再度曝光，不法厂家竟然将腐烂变质的杂皮或混了牛皮的边脚料做原料，更有甚者使用皮革下脚料投料来生产阿胶，给消费者的健康带来严重的隐患。无论是药品标准还是食品标准均无专属性强、灵敏度高的方法，对以上违法行为进行有效打击，无法有效保证公众饮食用药安全和保护消费者的利益。因此，针对以上胶类中药的质量问题，研究建立一系列行之有效的专属性鉴别方法和标准，并推广应用于相关药品的质量控制和市场监管中，对有效打击相关假冒伪劣产品的违法行为，正本清源，扶正祛邪，并保障人民饮食用药安全必将产生极大的社会经济效益，十分迫切，意义重大。
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第一章概述

这些方法都是蛋白质类成分的通用检测方法，专属性不强。加之，在制胶过程中，水解工艺的不同，可造成胶原分子的二级结构、水解肽种类、水解肽分子量大小、水解肽的物理性质不同，直接影响上述方法测定结果的稳定性。另外上述方法只是对正品和纯伪品的鉴别，而对于正品中掺加部分伪品（杂皮）的问题无能为力。这些方法都是蛋白质类成分的通用检测方法，专属性不强。加之，在制胶过程中，水解工艺的不同，可造成胶原分子的二级结构、水解肽种类、水解肽分子量大小、水解肽的物理性质不同，直接影响上述方法测定结果的稳定性。另外上述方法只是对正品和纯伪品的鉴别，而对于正品中掺加部分伪品（杂皮）的问题无能为力。这些方法都是蛋白质类成分的通用检测方法，专属性不强。加之，在制胶过程中，水解工艺的不同，可造成胶原分子的二级结构、水解肽种类、水解肽分子量大小、水解肽的物理性质不同，直接影响上述方法测定结果的稳定性。另外上述方法只是对正品和纯伪品的鉴别，而对于正品中掺加部分伪品（杂皮）的问题无能为力。这些方法都是蛋白质类成分的通用检测方法，专属性不强。加之，在制胶过程中，水解工艺的不同，可造成胶原分子的二级结构、水解肽种类、水解肽分子量大小、水解肽的物理性质不同，直接影响上述方法测定结果的稳定性。另外上述方法只是对正品和纯伪品的鉴别，而对于正品中掺加部分伪品（杂皮）的问题无能为力。

第三章胶类药材专属性鉴别信息库的建立............57
第一节特征图谱的建立..........57
第二节智能信息库的建立..................69
第四章胶类药材质量控制标准方法研究.....................71
第一节标准物质的研制.................71
第二节鹿角胶定性鉴别标准方法研究.....................77
第三节龟甲胶定性鉴别标准方法研究..................83
第四节阿胶定性鉴别标准方法研究............................89
第五章总结与讨论...................143

第四章胶类药材质量控制标准方法研究

第一节标准物质的研制
标准物质是质量标准标准中不可缺少的组成部分，本部分研究工作中，首先开展标准物质的研制工作。关于氧基酸的测定方法有柱前衍生化和柱后衍生化。经典的氣基酸分析方法是釆用柱后衍生、用审三酮作为衍生试剂的离子交换色谱法。此法需专门的仪器，分析时间也较长。随着技术的发展用反相柱、柱前衍生化法测定氣基酸取得了很大发展。该法快速和实验成本较低等优点其中法是因与氨基酸和亚氣基酸均能反应，并且生成产物稳定，而成为目前氣基酸分析中具有吸引力的分析方法之一。为此，研究建立了阿胶中经脯氣酸、甘氨酸、丙氧酸、脯氨酸种氣基酸的测定方法。

第二节鹿角胶定性鉴别方法研究
酸水解是氨基酸测定中最常用的样品制备方法。然而该方法可引起一些氣基酸的破坏或部分破坏，并由此带来分析结果的变动。其中色氨酸被破坏，丝氨酸和苏氣酸部分被破坏，蛋氣酸易被氧化，半耽氨酸一般转化为胱氛酸。由于本实验只测定轻脯氨酸、甘氣酸、丙氣酸、脯氨酸，这4种氣基酸不易被酸氧化破坏，故本实验仍采用酸水解法。本研究开展了检测用标准物质的研制工作，首次研制标定出鹿角胶、龟甲胶、黄明胶对照药材和牛皮特征肽对照品。并釆用高效液相色谱串联四级杆质谱联用技术，以鹿角胶、龟甲胶、阿胶、黄明胶对照药材和牛皮特征肽为对照，建立了鹿角胶、龟甲胶、阿胶的定性鉴别方法和用于打击违法使用杂皮投料生产龟甲胶、鹿角胶、阿胶的补充检验方法。
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第五章总结与讨论

本论文的创新之处：首次通过酶切技术及高效液相色谱质谱联用技术，确定各不同胶类药材的专属性特征肽段，并通过氨基酸序列分析和特征肽段的化学合成等手段，验证了特征肽段序列的正确性；首次将肽图分析和数学统计分析方法应用于胶类药材的真伪鉴定。通过各种胶类药材样品的色谱质谱信息库的建立和应用，首次建立胶类药材真伪识别专家系统；首次建立了分析检测用标准物质及鹿角胶、龟甲胶类药材定性鉴别标准方法。本研究所建立的相关检测方法和技术标准将应用于药品、保健食品、食品的质量控制和市场监管。对提升整个产业的质量和技术水平，保障公众用药安全有效，笔耕文化推荐期刊，维护消费者经济权益等方面，将产生深远的意义。
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