奥氮平介导的3T3-L1细胞SREBPs通路的脂代谢调控与药物联合作用

发布时间：2014-12-22 14:25

 

【摘要】 背景：抗精神药物为精神病的首选药物,主要分为两大类,第一代典型性抗精神药物和第二代非典型性抗精神药物。第一代抗精神药物对精神分裂症的阴性症状无明显效果,引起药源性锥体外系不良反应,尤其是不可逆的迟发性运动障碍的发生,严重地影响了患者的服药依从性,也妨碍社会功能的恢复。第二代抗精神药物在作用于DA受体的同时对于5-羟色胺(5-HT)受体具有更强的拮抗作用,不再引起药源性锥体外系不良反应,但是仍有一定的副作用,比如氯氮平,但其致粒细胞缺乏的发生率高达1‰～3‰,是其它抗精神病药的50-100倍,致使临床应用受到明显的限制。作为第二代抗精神药物的代表Olanzapine对5-HT受体亲和力高于DA受体的亲和力,且选择性作用于与精神活动关系密切的中脑边缘系统,因此对精神分裂症的阴性症状具有良好的疗效,对难治性精神分裂症也有较好的效果,且很少引起致粒细胞缺乏。但是也引起一些不良反应,比如脂类代谢紊乱,伴随有血脂异常、肥胖、糖尿病、心血管疾病及炎症等,尤其是血脂异常很普遍。由于临床还没有可以取代Olanzapine的药物出现,故Olanzapine的应用还是很广泛,于是在临床上寻找与Olanzapine联合用的,能改善抗精神病药物诱导的脂代谢异常的药物就显得很是迫切。Olanzapine引起脂代谢紊乱具体机制还不是很清楚,现已有报道其副作用与H1受体、脂肪生成因子以及SREBPs途径均有关系。最近有文献称Olanzapine的脂代谢紊乱有可能还具有反馈调节作用。他汀类药物,为降血脂的一线药物,可通过竞争性抑制HMG-CoA还原酶,在减少肝脏合成胆固醇的同时,还能增加ILDLC受体数量和活性、增加血清胆固醇的清除,进一步降低TC水平。那么能否推测他汀类药物可以通过SREBPs相关途径来抑制Olanzapine引起的HMG-CoA还原酶增强,从而干预Olanzapine引起的脂代谢变化,值得关注。此外,Berberine是从小檗属、黄连属植物根茎中提取的一种异喹啉类季铵生物碱,主要用于肠道炎症伴发热,具有抗菌、止泻、抗心律失常、抗高血压、降血脂等作用。现有较多文献报道Berberine降血脂效果较显著,其具体机制还不是很清楚。有文献报道通过Berberine通过调节SREBPs相关途径(包括PPAR γ和C/EBP α),抑制3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞、人类白前脂肪细胞以及高脂肪饮食诱导的肥胖鼠模型中的脂肪细胞分化过程中脂肪生成。因此Berberine与Olanzapine联合用药,能否干预Olanzapine介导的3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞脂代谢变化,从而应用于临床上Olanzapine引起的脂代谢紊乱,值得研究。目的：在3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞(前脂肪细胞)水平上,建立Olanzapine诱发脂代谢的成熟脂肪细胞模型,研究Olanzapine通过SREBPs途径诱发的脂代谢副作用,分析他汀类药物和Berberine对其的干预作用及其分子机制。方法：采用MTT比色法考察DMSO、Olanzapine、Simvastatin、Atorvastatin、Berberine等对3T3-L1细胞增殖的影响,从而找出上述药物具有较低细胞毒性的浓度范围；利用倒置显微镜观察细胞形态、油红O染色脂滴,试剂盒检测TG、TC含量,RT-qPCR基因转录分析及Western blotting分析蛋白表达四个方面来考察Olanzapine是否成功诱导形成成熟脂肪细胞模型,并且选出最佳的Olanzapine浓度；在此基础上选择以上四个方面来研究他汀类药物和Berberine是否干预Olanzapine介导的脂代谢变化以及相关分子机制。结果：1. Olanzapine介导的脂代谢变化细胞模型的建立Olanzapine能促进脂肪细胞脂滴的形成,在低于10μmol/L浓度,呈剂量依赖性,超过10μmol/L后诱导效果不明显。并且在10μmol/L浓度时对TG, TC含量、基因转录水平、蛋白表达水平都有一定的下调作用。2. Simvastatin对Olanzapine引起的脂代谢变化的干预作用在2.5μmol/L和5μmol/L Simvastatin作用下,可看到细胞形态观察的改变以及油红O染色脂滴数量的下降,TG, TC含量测定、基因转录分析及蛋白表达水平方面都进一步验证了Simvastatin可以干预Olanzapine引起的脂代谢变化。3. Atorvastatin对Olanzapine诱发的脂代谢变化的影响在2.5μmol/L和5μmol/L Atorvastatin作用下,基本上看不到细胞形态观察的改变以及油红O染色脂滴数量的下降,在TG、TC含量测定、基因转录分析及蛋白表达水平等方面也没有较大的变化。4. Berberine对Olanzapine介导的脂代谢变化的效应在1.25μmol/L和2.5μmol/L Berberine作用下,可明显看到细胞形态观察的改变以及油红O染色脂滴数量的下降,TG, TC含量测定、基因转录分析及蛋白表达水平方面都进一步验证了Berberine可以干预Olanzapine引起的脂代谢变化。结论：本研究分析了Olanzapine介导的3T3-L1脂肪细胞脂代谢特征,建立了相应的细胞模型。通过应用此模型,筛选到Simvastatin和Berberine与Olanzapine联合用药,能在一定程度上干预SGAs的代表药物olanzapine引起的脂代谢副作用,为临床上联合用药提供理论基础。 

第1章综述

1.1抗精神病药物
抗精神病药(Antipsychotic Drug)主要用于治疗精神分裂症及其他精神失常的狂躁症状。目前为止精神异常疾病的首选治疗仍为各类抗精神病药，主要包括两个大类：即第一代抗精神病药(First Generation Antipsychotic Drugs, FGAs)，又称典型性抗精神病药,其主要为DA2受体阻断剂，如氯丙嗪(Chloropromazine)，氟呢淀醇(Haloperidol，HAL)等；第二代抗精神病药(Second Generation Antipsychotic Drugs, SGAs),又称非典型性抗精神病药，如氯氮平(Clozapine)、奥氮平(Olanzapine)、奎硫平(Quetiapine)、利培酮(Risperidone)、舍 B引哚(Sertindole)、齐拉西酮(Ziprasidone)等，在作用于DA受体的同时对5-HT受体具有更强的拮抗作用，不再引起药源性锥体外系不良反应。FGAs的近期疗效仅为50%?60%，对精神分裂症阳性症状的改善效果显著，但却无法改善精神分裂症的阴性症状，引起很严重的药源性锥体外系不良反应，特别是能造成不可逆的迟发性运动障碍，严重地影响了患者的服药依从性及妨碍社会功能的恢复[3]。而SGAs在作用于DA受体的同时对于5-HT受体具有更强的抬抗作用，对精神分裂症阳性和阴性症状都有效，尤其是对精神分裂症的阴性症状作用明显，也可减轻伴发的抑郁、焦虑及认知缺陷等症状，较少引起锥体外系不良反应及迟发性运动障碍，具有较好的远期疗效[4]。由于其具有广谱且可忍受的副作用，SGAs已经替代传统的抗精神病药，成为一线抗精神病药。近年来，研究显示SGAs还具有一定的神经营养、保护作用。
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1.2抗精神药物Olanzapine诱发的脂代谢变化及其相关机制
目前临床上Olanzapine的副作用有代谢性疾病特征，伴随有血脂异常、肥胖、心血管疾病，血糖失调(糖尿病、葡萄糖耐受措抗)以及一些炎症等。其中比较显著的副作用为为脂代谢紊乱，甚至在一些研究中有报道Olanzapine能引起血清胆固醇水平升高由于这些副作用的存在，造成了心血管患者的死亡率增加，患者的服药顺从性降低，使其在治疗精神病方面受到了一定的限制[12]?虽然存在这些问题，但是由于临床还没有可以取代Olanzapine的药物出现，所以Olanzapine的应用还是很广泛，于是临床寻找改善抗精神病药诱导的脂代谢异常的药物就很是迫切[13]。
抗精神药物的副作用脂代谢紊乱似乎与大脑的D2受体阻滞相关，具体分子机制还不是很清楚。通过对下丘脑5-HTC和HI受体的拮抗作用，笔耕文化推荐期刊，抗精神药物诱导的体重增加似乎与食欲刺激相关,也有可能与其他机制也相关。
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第2章材料与方法

2.1主要材料
2.1.1细胞系
小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；
2.1.2主要试剂
Olanzapine(购自大连美企生物技术有限公司批号：132539-06-1)；Rosiglitazone(购自大连美企生物技术有限公司批号：122320-73-4);
Simvastatin(购自大连美仓生物技术有限公司批号：79902-63-9)
Atorvastatin(购自大连美企生物技术有限公司批号：134523-03-8
)Berberine(购自中国药品生物制品检定所批号：110713)
Insulin (购自 Sigma 批号：15500)
IBMX(购自Sigma公司批号：15879)
Dexamethasone(购自上海生工生物批号：DN1187)
D-Biotiii(购自上海生工生物批号：BB0078)
DMEM-High细胞培养基(购自Hyclone);
胎牛血清(购自Hyclone);
RNA Simple Total RNAKiUTIANGEN 生物技术公司批号：DP419)
Transcriptor First Strand DNA Synthesis Kit (Roche 公司批号：0489686600)
SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems 公司，4472897)
RIPA蛋白提取液提取液(购自北京鼎国昌盛生物公司货号：WB-007)
Easy Protein Quantitative Kit(TransGen 公司货号：DQ101-01)
Anti-LDL Receptor antibody (Abeam 公司批号：ab30532)Anti-SREBP2 antibody (Abeam 公司批号：ab30682)
p -Actin Rabbit Polyclonal Antiboby(北京鼎国昌盛生物公司，批号：AC001-R);
Anti-RbIgG(H+L)/HRP(北京鼎国昌盛生物公司批号：ffl-0011)
ECL显影剂(Genview公司）DMSO(Sigma公司，鼎国分装)；
甘油三醋(TG)测试盒(南京建成生物工程研究所货号：F001-2)
总胆固醇(TC)测试盒(南京建成生物工程研究所货号：F002-2)
其他化学试剂均购自上海生工和鼎国生物。
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2.2方法
2.2.1细胞培养
(-)细胞培养及形态学观察
3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞培养所用培养基含10%胎牛血清的DMEMH完全培养基，含lOOIU/mL青霉素、lOOug/mL链霉素，其培养在37°C，含5%C02,饱和湿度的恒温培养箱。成纤维细胞需要每3天换一次液。一般大概3天细胞会分裂铺满培养皿的50%，这个时候需要消化传代。一定不要让它长的超过皿的70%。如果细胞长满，超过24h,传代后，细胞就不能很好的分化。在细胞传代20次后就不要再传代了，因为这样的话，细胞就不会很好的分化了。所以在每次传代后，要做好标记。
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第3章 实验结果 ................................31-51 
3.1 诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞 ..................31 
3.2 药物对3T3-L1细胞增殖的影响............. 31-35 
3.2.1. DMSO对3T3-L1细胞增殖的影响 ..........................31-32 
3.2.2. Olanzapine对3T3-L1细胞增殖的影响 ............32-33 
3.2.3. Simvastatin对3T3-L1细胞增殖的影响 .....................33-34 
3.2.4. Atorvastatin对3T3-L1细胞增殖的影响............. 34 
3.2.5. Berberine对3T3-L1细胞增殖的影响 ................34-35 
3.3 Olanzapine对成熟脂肪细胞脂代谢的影响 ..........35-38 
3.3.1. 油红O染色观察脂肪滴的变化.......................... 35-36 
3.3.2. Olanzapine介导的脂肪细胞TG、TC含量的检测 ....................36 
3.3.3. Olanzapine介导的脂肪细胞的相关调控基因转录水平分析.......................... 36-38 
3.4 Simvastatin对Olanzapine介导的脂代谢变化的影响 ................38-42 
3.4.1. 油红O染色观察脂肪滴的变化 ........................38-39 
3.4.2. Simvastatin对Olanzapine介导的TG、TC含量的变化 ...........................................39-40 
3.4.3. Simvastatin联合Olanzapine条件下的相关调控基因转录水平分析 ..................40-41 
3.4.4. Simvastatin与Olanzapine共同作用下SREBP2和LDLR蛋白的表达分析 ................................41-42 
3.5 Atorvastatin对Olanzapine介导的脂代谢变化的干预 .........................42-46 
3.5.1. 油红O染色观察脂肪滴变化 .............................42-43 
3.5.2. Atorvastatin对Olanzapine介导的TG、TC含量的调控 ..................43 
3.5.3. Atorvastatin联合Olanzapine条件下的相关调控基因转录水平分析.................................. 43-45 
3.5.4. Atorvastatin与Olanzapine联合对SREBP2和LDLR蛋白的表达调控情况........................... 45-46 
3.6 Berberine对Olanzapine介导的脂代谢变化的影响 ...........46-51 
3.6.1. 油红O染色观察脂肪滴变化........................ 46-47 
3.6.2. Berberine对Olanzapine介导的TG、TC含量的影响.............................. 47 
3.6.3. Berberine联合Olanzapine条件下的相关调控相关基因转录水平分析.......................... 47-49 
3.6.4. Berberine与Olanzapine联合对SREBP2和LDLR蛋白表达的调控情况 ...........................49-51 

第4章 讨论与分析

当前社会生活节奏越来越快，生活压力也越来越大，导致精神方面的疾病也越来越多。由于第二代抗精神药物SGAs具有广谱且可忍受的副作用，SGAs已经替代传统的抗精神病药，成为当前临床上治疗精神分裂症及其他精神失常的狂躁症状的首选药。目前，临床上Olanzapine的副作用主要为代谢紊乱，比如肥胖、高甘油三酷血症、血糖失调(糖尿病、葡萄糖耐受拮抗)等，尤其是脂代谢素乱已经影响了患者的服药顺从性，所以寻找能干预脂代谢紊乱的药物就显得很是迫切。
4.1  Olanzapine介导的3T3-L1脂肪细胞脂代谢变化模型的建立
脂代谢紊乱是SGAs治疗精神失常的过程中引起的主要副作用之一。由于该副作用的存在，增加了心血管患者的致死率，降低了患者的服药顺从性，使其在临床上的应用受到的一定的限制。本研究中，我们选0.1%DMSO为对照组，不同浓度的Olanzapine均能一定程度的促进3T3-L1脂肪细胞脂滴数量和体积的增加，50 jimol/L Olanzapine诱导3T3-L1脂肪细胞脂滴生成的效果次于10 nmol/L Olanzapine;并且与对照组相比，经过Olanzapine处理的脂肪细胞的TG、TC含量均有一定的增加，在前呈上升趋势，而在50 jmiol/L处稍有下降。1 nmol/L Rosiglitazone, PPARy激动剂，作为阳性对照，能显著性的促进脂肪的生成。由图8可知，随着Olanzapine浓度的加大，它对3T3-L1细胞的毒性增加，当高于50 jimol/LOlanzapine对3T3-L1细胞的毒性已经大于20%，抑制前脂肪细胞分化为脂肪细胞。故lO^mol/L Olanzapine能最大程度的诱导成熟的脂肪细胞的脂滴形成，建立较佳的脂代谢变化细胞模型，为后面的他汀类药物和Berberine干预Olanzapine引起的脂代谢变化提供模型。通过对基因转录差异分析检测，10iimol/L Olanzapine均能显著性的上调Ppary、C/EBPa、Srebpl、Srebp2、HmgcR和LdlR基因的表达，其对这6个基因的调控能力明显高于其他浓度的Olanzapine0进一步验证了，Olanzapine能通过SREBPs途径介导3T3-L1脂肪细胞的脂代谢变化。
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结论

1.Olanzapine介导的脂代谢变化细胞模型的建立
Olanzapine能促进脂肪细胞脂滴的形成，在低于10 nmol/L浓度，呈剂量依赖性，超过10nmol/L后诱导效果不明显。并且在10 pmol/L浓度时对TG、TC含量、基因转录水平、蛋白表达水平都有一定的下调作用。
2.Simvastatin对Olanzapine引起的脂代谢变化的干预作用
在2.5 ^mol/L和5 nmol/L Simvastatin作用下,可看到细胞形态观察的改变以及油红0染色脂滴数量的下降，TG、TC含量测定、基因转录分析及蛋白表达水平方面都进一步验证了Simvastatin可以干预Olanzapine引起的脂代谢变化。
3.Atorvastatin对Olanzapine诱发的脂代谢变化的影响
在2.5 nmol/L和5 |umol/L Atorvastatin作用下，基本上看不到细胞形态观察的改变以及油红0染色脂滴数量的下降，在TG、TC含量测定、基因转录分析及蛋白表达水平等方面也没有较大的变化。
4.Berberine对Olanzapine介导的脂代谢变化的效应
在1.25 |xmol/L和2.5 |xmol/L Berberine作用下，可明显看到细胞形态观察的改变以及油红0染色脂滴数量的下降，TG、TC含量测定、基因转录分析及蛋白表达水平方面都进一步验证了 Berberine可以干预Olanzapine引起的脂代谢变化。
本研究分析了 Olanzapine介导的3T3-L1脂肪细胞脂代谢特征，建立了相应的细胞模型。通过应用此模型，蹄选到Simvastatin和Berberine与Olanzapine联合用药，能在一定程度上干预SGAs的代表药物olanzapine引起的脂代谢副作用，为临床上联合用药提供理论基础。

参考文献：

[1] 徐艳丽,李青菊.  辛伐他汀与阿托伐他汀对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞p27蛋白表达的影响[J]. 重庆医学. 2013(28)
[2] 王磊,胡昌华.  他汀类药物抗癌作用新机制[J]. 中国药学杂志. 2010(23)
[3] Ping Yi, Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China Fu-Er Lu, Li-Jun Xu, Guang Chen, Kai-Fu Wang, Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China.  Berberine reverses free-fatty-acid-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes through targeting IKKβ[J]. World Journal of Gastroenterology. 2008(06)


本文编号：10807