干扰素对猪肝脏关键药物代谢酶CYP3A29的表达调控研究

发布时间：2014-12-25 09:48

 

【摘要】 细胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP450)是机体重要的药物代谢酶,涉及内源性和外源性物质以及几乎所有药物和其衍生物的代谢。另一方面,内源性、外源性化合物也能够诱导或抑制CYP450的表达,而严重影响着药物的代谢、疗效和安全性。CYP3A29是猪体内最重要最丰富的药物代谢酶之一,是人重要药物代谢酶CYP3A4的研究模型。干扰素(Interferon, IFN)作为新型生物药物已被广泛应用于医学临床及兽医临床,使用过程中通常需要与其它药物联合应用,以达到更好的效果,但其对机体药物代谢酶的表达调控机制尚不清楚,由此导致的药物代谢酶的表达及活性的变化严重影响着对药物的代谢、疗效和安全性,经常导致药效降低、产生毒副反应及药物残留,给临床合理用药带来了很大困难,既造成了药物的浪费,又严重影响人和动物的健康。因此研究干扰素对猪CYP3A29表达调控的影响及其机制的调节,既能指导兽医临床用药,又能为医学临床合理用药提供理论依据。本研究从细胞水平及动物活体水平研究了干扰素对CYP3A29表达的影响,并探讨了其分子机制,取得的结果如下：1. IFN-a与IFN-y在细胞水平对CYP3A29表达的影响分离制备猪肝原代细胞,MTT还原法分别检测IFN-a与IFN-y对猪肝细胞活性影响,证实IFN-a与IFN-y对其无细胞毒性作用；分别用不同剂量IFN-a与IFN-y在不同时间点处理猪原代肝细胞和传代肝细胞HepLi,应用实时荧光定量PCR和Westen-blot检测肝细胞的CYP3A29在mRNA水平和蛋白质的变化,结果表明IFN-a与IFN-y均能显著上调CYP3A29表达,且具有一定的时间、剂量相关性。2. IFN-a与IFN-y在动物活体水平对CYP3A29表达及酶活性的影响分别用IFN-a与IFN-y肌肉注射30日龄仔猪,采用差速离法(Differential celltrifugation method)制备猪肝微粒体。应用实时荧光定量PCR和Westen-blot测定CYP3A29mRNA和蛋白质水平变化,结果表明IFN-a与IFN-y均能显著上调CYP3A29表达,且与细胞水平相一致；以人CYP3A4的特异性底物硝苯地平作为探针,尼群地平作为内标,用高效液相色谱法测定硝苯地平氧化代谢产物氧化型硝苯地平含量,分析CYP3A29酶活性变化,表明猪CYP3A29基因与人CYP3A4基因致,具有硝苯地平氧化代谢活性,且IFN-a与IFN-y能激活CYP3A29酶代谢活性。3. IFN-a与IFN-y对孕烷受体PXR表达的影响分别用不同剂量IFN-a与IFN-y在不同时间点处理猪原代肝细胞和传代肝细胞HepLi,应用实时荧光定量PCR和Westen-blot检测PXR在mRNA水平和蛋白质的变化,结果表明IFN-α与IFN-γ均能显著上调PXR表达,且与CYP3A29的表达具有一致性；动物实验样品荧光定量PCR和Westen-blot检测结果与细胞水平检测结果相一致。4. IFN-α与IFN-γ对CYP3A29表达调控机制分别构建PXR真核表达质粒pcDNA3.1-PXR及6个CYP3A29不同长度启动子荧光素酶报告质粒；在MTT还原法检测转录抑制剂DRB对猪肝细胞无细胞毒性作用基础上,通过转录抑制试验确定肝脏药物代谢酶CYP3A29的启动子在IFN-α与IFN-γ调控中的作用,采用细胞转染PXR真核表达质粒和siPXR使核受体PXR超表达或者沉默,转染不同长度的CYP3A29启动子片段,探讨IFN-α与IFN-γ上调CYP3A29表达的分子机制。实验结果表明：(1) IFN-α与IFN-γ通过激活CYP3A29启动子上调CYP3A29的表达,IFN-α与IFN-γ激活CYP3A29转录部位是位于转录起始上游-1473至-1021区域；(2) IFN-α与IFN-γ处理细胞后,PXR mRNA上调先于CYP3A29mRNA发生,推断PXR作为转录因子参与激活CYP3A29表达；(3)PXR超表达试验和RNA干扰试验表明IFN-α与IFN-γ激活CYP3A29的表达与核受体PXR相关。

第一章文献综述

1.1 干扰素（Interferon，IFN)
干扰素（Interferon，IFN)是由细胞基因控制、在特定诱导剂的作用下产生的一类细胞因子，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性。随着基因工程技术的发展，干扰素生物学活性、产生及其作用机理得到了阐明，为其临床应用提供了理论依据。目前作为新型生物药物，干扰素已被广泛应用于医学临床病毒性疾病及肿瘤的治疗，笔耕文化推荐期刊，在兽医临床中被广泛用于病毒性疾病的预防和治疗（陈雪2006;张真2007;张海玲和闻喜军2008)。
上个世纪80年代美国国家过敏症与传染病研究所和世界卫生组织根据抗原的特异性，把干扰素分为三类：IFN-a、IFN-p和IFN-y。后来，又根据干扰素共同享用受体的不同被分为I型、II型和III型干扰素。I型包括IFN-a、IFN-P、IFN-O)和IFN-x, II 型包括 IFN-y (Jonasch and Haluska 2001 )； III 型指 IFN-?o。几乎所有类型细胞都可以分泌I型干扰素，具有代表性的是白细胞和成纤维细胞分泌的IFN-a和IFN-P，而IFN-y由T-细胞和自然杀伤细胞（NK)分泌，IFN-X主要在对病毒的自然免疫中在肝细胞、单核细胞等为数不多的几种细胞中有分泌（Sheppardetal2003)。
干扰素基因基本上都是由四部分组成：5’非编码区、成熟肽编码区、信号肽编码区和3’非编码区。5’非编码区具有一定的保守区域，它对干扰素基因转录的起始调控和识别具有重要的作用，一些保守区的序列可能与病毒诱生有关。信号肽在不同的干扰素中数目也不相同，信号肽指导干扰素前体运输到细胞膜，然后被切除，使成熟的干扰素分泌到细胞外。不同干扰素的氨基酸数目、组成种类各不相同，其结构也各有差异（胡慧珍和思汗2009)。
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1.2 细胞色素 P450 (cytochrome P450, CYP450)
细胞色素P450是亚铁血红素-硫醇盐蛋白（heme-thiolate proteins)的超家族的成员，它们在绝大多数的内源性物质的代谢中起到重要的作用，如氧化作用、超氧化作用及还原作用等；这些内源性物质包括：脂肪酸、类固醇激素、前列腺素、胆汁酸以及脂溶性的维生素等。细胞色素P450对保持多种化合物在不同的细胞过程中的平衡起到重要的维护作用。此外，细胞色素P450中很多酶对外源性物质如药物、致癌物质以及环境污染物的代谢起到重要作用，这些外源性物质在P450酶的作用下，通过I相代谢作用，使亲脂性的物质转化成水溶性物质以利于排除体外(Goodwin et al 2002)。细胞色素P450受到了研究者的广泛关注，截止到2013年底，大约有6.9万篇关于细胞色素P450的研究报道（Renault etal 2014)，最初的报道主要见于细胞色素P450在哺乳动物中与代谢有关的医学和药理学研究，现在植物、微生物领域都有相关研究报道。
1.2.1细胞色素P450的发现与分布
1958年，Klingberg和Grfinkle分别在大鼠和猪上发现一种膜结合的微粒体蛋白组分，它与一氧化碳结合后在450nm处有一明显的吸收峰，随后这种蛋白被证实为细胞色素P450。由于其独特的在光谱450nm处有吸收峰，因此被命名为P450。
细胞色素P450分布十分广泛，在动物、植物、微生物中均已发现它的存在。在脊椎动物中，细胞色素P450含量最丰富的器官是肝脏，这与其功能相适应，其次是小肠。在其他器官或组织中也均有分布，如：肾脏、肺、胎盘、皮肤、肾上腺、睾丸、大脑以及主动脉等（任彭和刘兆平2006)。
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第二章IFN-a对猪肝脏关键药物代谢酶CYP3A29表达的影响

2.1前言
干扰素（Interferon，IFN)是由细胞基因控制、在特定诱导剂的作用下产生的一类细胞因子，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性。根据干扰素共同享用受体的不同被分为I型、n型和III型干扰素，IFN-a属于I型干扰素，有强大的抗病毒作用。随着基因工程技术的发展，IFN生物学活性、产生及其作用机理得到了阐明，为其临床应用提供了理论依据。目前作为新型生物药物，IFN已被广泛应用于医学临床病毒性疾病及肿瘤的治疗（Campbell et al 1999； Yoshiji et al 2005；Radaeva et al 2002；刘金旭和陈文梅2010)。并且在兽医临床中被应用于病毒性疾病的预防和治疗（陈雪2006;张真2007;张海玲和闫喜军2008)。尽管如此，对于IFN仍有许多问题亟待解决。尤其是在临床上，IFN经常需要与其它药物联合应用，以达到更好的效果。但是IFN对机体药物代谢酶的表达调控及分子机制尚不清楚，由此导致的药物代谢酶的表达及活性的变化严重影响着对药物的代谢、疗效和安全性，经常导致药效降低或产生毒副反应，给临床合理用药带来了很大困难，既造成了药物的巨大浪费，又严重影响着人和动物的健康。
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2.2实验材料
2.2.1细胞系
传代肝细胞系HepLi由浙江大学医学院李兰娟教授馈赠。
2.2.2分子生物学相关试剂
rTaq DNA 聚合酶（Takara)，RNA 提取试剂 RNAiso Plus Reagent (TaKaRa),PrimeScript反转录酶(TaKaRa),荧光定量试剂(Bio-Rad)，青链毒素溶液(Hyclone),DL2000(东盛)，DL15000(东盛)，dNTP(TaKaRa),细胞裂解缓冲液 RIPA Buffer(Pierce),蛋白酶抑制剂（Pierce)，蛋白酶 K (sigma), IFN-a 购自 Kingfisher 公司，CYP3A29 抗体、P-actin 抗体、PXR 抗体购自 Santa Cruz Biotechnology 公司，羊抗鼠_标二抗购自武汉三鹰公司，DMEM高糖培养基、DPBS缓冲液、OPTI-MEM、胎牛血清购自美国GIBCO公司，P-NADP、G6PDH、硝苯地平、氧化型销苯地平购于Sigma，尼群地平购于中国药品检查所，甲醇、乙腈为色谱纯，本试验所用的其它化学试剂均为国产分析纯。
2.2.3实验动物
3日龄二元杂交猪购自华中农业大学实验猪场；22日龄二元杂交猪购自中粮集团。
2.2.4试剂配制
0.5 mol/L EDTA： EDTA-NazIfcO 18.61 g, ddl^O 溶解，剧烈搅拌，加入 NaOH将pH调至8.0，定容至100 mL，高压灭菌，冷却后4°C保存。
电泳缓冲液(50XTAE)： Tris base 242 g,冰乙酸 57.1 mL，0.5 mol/L (pH8.0)EDTA 100 mL, ddHaO 溶解，定容至 1000 mL。
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第三章 IFN-γ对猪肝脏关键药物代谢酶CYP3A29表达的影响 .............58-74 
3.1 前言..................... 58-59 
3.2 实验材料............... 59 
3.2.1 细胞系.................................. 59 
3.2.2 分子生物学相关试剂 ......................59 
3.3 实验方法 ....................59-63 
3.3.1 动物试验 .............................59 
3.3.2 细胞培养及基本指标检测 .......................59 
3.3.3 IFN-γ对猪肝细胞的毒性试验(MTT法) .....................59-60 
3.3.4 RNA提取及浓度测定................ 60 
3.3.5 蛋白质提取及浓度测定........................ 60 
3.3.6 猪肝微粒体CYP3A29代谢硝苯地平速率的测定...................... 60 
3.3.7 实时荧光定量PCR检测IFN-γ对CYP3A29和PXRmRNA表达的影响 .........60-62 
3.3.8 Western-bolt检测IFN-γ对CYP3A29和PXR蛋白表达的影响................ 62 
3.3.9 统计学方法 ..................62-63 
3.4 结果与分析 ...................63-72 
3.4.1 MTT法测定IFN-γ对细胞的毒作用 .........................63 
3.4.2 实时荧光定量方法确立 ...............................63 
3.4.3 蛋白质浓度测定 ........................63-65 
3.4.4 IFN-γ对猪原代肝细胞CYP3A29和PXR表达的影响 .............65-67 
3.4.5 IFN-γ对猪传代肝细胞CYP3A29和PXR表达的影响 ....................67-70 
3.4.6 IFN-γ激活猪肝药物代谢酶CYP3A29的表达、提高酶代谢活性............ 70-72 
3.5 讨论 ...............................72-74 

第四章 IFN-α与IFN-γ对CYP3A29表达调控的分子机制

4.1前言
细胞色素P450是亚铁血红素-硫醇盐蛋白（heme-thiolate proteins)的超家族的成员，它们在绝大多数的内源性物质的代谢中起到重要的作用，涉及内源性和外源性物质以及几乎所有药物和其衍生物的代谢。CYP3A4是人CYP450中最丰富和最重要的药物代谢酶，可代谢超过50%临床现存处方药物。干扰素在临床上被广泛的用于抗病毒的治疗，但是其如何调节P450酶的表达尚不清楚。因为人体临床研究的局限性，使得这方面的研究进展的缓慢。猪的被认为是研究药物的吸收和代谢合适动物模型，因此研究干扰素对猪CYP3A29表达调控的影响及其机制的调节，能为医学临床合理用药提供理论依据。
近年来研究还表明，孕焼X受体（Pregnane X Receptor，PXR)是核受体超家族的重要一员，用配体——受体方式调节目的基因的转录（Guetal2006)，化学药物调节P450酶表达变化通常依赖PXR介导说我途径（Shi etal 2010)。此外，进来研究表明，一些生物药物也能激活PXR,从而调节CYP3 A的表达（Yang etal 2010)。
基于以上所述，本人构建了 CYP3A29及PXR真核表达载体的基础上，拟以人最重要的药物代谢酶CYP3A4的研究模型——猪CYP3A29为研究对象，拟通过体内动物实验、肝脏原代细胞分离培养，从动物活体水平及细胞水平，利用定量RT-PCR、Westem-blot方法，系统分析IFN-a、y对CYP3A29表达的影响；通过转录抑制、转染、启动子报告基因等方法分析IFN对CYP3A29的转录调控；通过RNAi和基因转染超表达方法研究孕烧X受体在CYP3A29表达调控中的作用。该研究将为生物药物对CYP450表达调控研究提供理论依据，为兽医及医学临床合理用药提供理论指导，对提高药物疗效，降低毒副反应和节约资金具有重要意义。
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总结

细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450)是机体重要的药物代谢酶，涉及内源性和外源性物质以及几乎所有药物和其衍生物的代谢。另一方面，内源性、外源性化合物也能够诱导或抑制CYP450的表达，而严重影响着药物的代谢、疗效和安全性。CYP3A29是猪体内最重要最丰富的药物代谢酶之一，是人重要药物代谢酶CYP3A4的研究模型。干扰素（Interferon，IFN)作为新型生物药物已被广泛应用于医学临床及兽医临床，使用过程中通常需要与其它药物联合应用，以达到更好的效果，但其对机体药物代谢酶的表达调控机制尚不清楚，由此导致的药物代谢酶的表达及活性的变化严重影响着对药物的代谢、疗效和安全性，经常导致药效降低、产生毒副反应及药物残留，给临床合理用药带来了很大困难，既造成了药物的浪费，又严重影响人和动物的健康。因此研究干扰素对猪CYP3A29表达调控的影响及其机制的调节，既能指导兽医临床用药，又能为医学临床合理用药提供理论依据。本研究从细胞水平及动物活体水平研究了干扰素对CYP3A29表达的影响，并探讨了其分子机制。

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 参考文献:

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本文编号：10860