嘧啶类衍生物的设计合成及其抑制EMT和血管生成的作用机制研究

发布时间：2017-10-17 14:30

  本文关键词：嘧啶类衍生物的设计合成及其抑制EMT和血管生成的作用机制研究

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【摘要】：肿瘤转移是肿瘤向恶性发展的一个主要标志,也是导致90%癌症患者死亡的重要因素,其发生发展涉及多个生物学过程,而上皮间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤转移的关键步骤。发生EMT的肿瘤上皮细胞会丧失极性,与周围组织细胞和基质的粘连减少,同时上皮表型缺失,逐渐转化为更有利于转移的间质表型,促进癌症的发展。另外,肿瘤的侵袭和迁移也需要血管网的参与,新生血管进入实体瘤内部,为细胞提供氧气、营养物质、生长因子等和肿瘤细胞转移的便利通道。因此,运用小分子化合物干扰EMT过程和新生血管的生成可以抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和迁移,诱导肿瘤细胞的凋亡。本课题组运用药物拼合原理成功合成了一系列含类脲结构单元的嘧啶类衍生物,并对其进行了EC109、MGC-803、MCF-7和B16-F10四种肿瘤细胞的体外活性评价。其中,B16-F10是小鼠黑色素瘤高转移细胞株,已广泛地用于肿瘤发展和转移过程的相关研究,结果显示多数化合物对B16-F10细胞表现出较好的增殖抑制活性,提示该系列化合物可能对EMT过程有一定的抑制作用。与此同时,有研究报道含有嘧啶骨架和类脲单元的化合物多具有酪氨酸激酶抑制活性,尤其是对抗血管生成重要靶标VEGF/VEGFR2信号转导通路抑制作用更明显,提示化合物可能对血管生成也有一定的影响。因此,本课题选择了对B16-F10增殖抑制活性最好的化合物38作为代表化合物进行一系列实验,检测其对EMT和血管生成相关的作用,初步探索其抗肿瘤作用机制。首先,我们选取B16-F10和MGC-803细胞作为受试细胞,运用划痕实验、Transwell实验初步证实了化合物38能够显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。作用机制研究显示化合物38可以抑制EMT的调控因子Snail、Slug和ZEB-1的表达,同时上调上皮标志蛋白E-Cadherin、ZO-1的表达,下调间质标志蛋白N-Cadherin、Vimentin的表达,并阻止β-catenin入核、降低细胞中MMP-2和MMP-7的蛋白表达水平,干扰EMT过程的进展,从而抑制MGC-803细胞的迁移和侵袭。同时,化合物38还可能通过线粒体途径与死亡受体途径共同诱导MGC-803细胞的凋亡。实体肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管生成,在肿瘤细胞转移的过程中,血管为肿瘤细胞的循环和远程转移提供了便利的条件,目前,抗血管生成已成为临床上治疗癌症的重要手段。因此,我们选择人脐静脉内皮细胞HUVEC作为受试细胞进行血管生成方面的研究。细胞增殖抑制实验、划痕实验、Transwell实验和小管形成实验证实了化合物38可以体外抑制内皮细胞的生长、迁移、侵袭和血管网的形成,而鸡胚尿囊膜实验又进一步验证了化合物38能够抑制体内血管的形成。Western Blot结果显示,化合物38作用后可使HUVEC细胞中VEGF和Bcl-2表达明显下调,而Bax和p53的表达明显增加,提示化合物38可能是通过VEGF/VEGFR2信号通路和凋亡通路共同抑制肿瘤新生血管的生成。综上所述,本课题运用药物拼合原理合成了一系列结构新颖的嘧啶类化合物,部分化合物表现出较好的抗肿瘤活性,其中化合物38能够一定程度上抑制EMT和血管生成,诱导肿瘤细胞的凋亡,最终抑制肿瘤转移和侵袭的发生。本研究初步阐述了化合物的作用机制,为后续的结构优化和作用靶点的研究提供了重要的实验依据。
【关键词】：嘧啶 脲 EMT 血管生成 侵袭 转移
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R914.5;R91
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 前言12-30
• 1.1 EMT的研究进展12-15
• 1.1.1 EMT的作用机制12-13
• 1.1.2 EMT与肿瘤的关系13-15
• 1.2 肿瘤血管生成机制及VEGF/VEGFR信号通路抑制剂15-23
• 1.2.1 肿瘤血管生成机制15-16
• 1.2.2 VEGF/VEGFR信号通路与肿瘤血管生成16-17
• 1.2.3 VEGF/VEGFR信号通路抑制剂17-23
• 1.3 课题的提出与设计23-24
• 参考文献24-30
• 2 含脲、1,2,3-三氮唑结构单元嘧啶类衍生物的设计、合成及体外抗肿瘤活性评价30-46
• 引言30-31
• 2.1 实验材料31-33
• 2.1.1 实验细胞株31
• 2.1.2 实验仪器与设备31-32
• 2.1.3 实验试剂32
• 2.1.4 相关溶液的配制32-33
• 2.2 实验方法33-37
• 2.2.1 细胞培养33-34
• 2.2.2 细胞增殖抑制实验34-35
• 2.2.3 划痕实验35
• 2.2.4 Transwell迁移实验35-36
• 2.2.5 Transwell侵袭实验36-37
• 2.2.6 统计学方法37
• 2.3 实验结果37-43
• 2.3.1 含脲、1,2,3-三氮唑结构单元嘧啶类衍生物的合成37-40
• 2.3.2 含脲、1,2,3-三氮唑结构单元嘧啶类衍生物的体外抗肿瘤活性评价40-42
• 2.3.3 化合物38对B16-F10的迁移、侵袭的抑制作用42-43
• 小结43
• 参考文献43-46
• 3 化合物38抑制胃癌细胞MGC-803的转移和侵袭研究46-69
• 引言46
• 3.1 实验材料46-51
• 3.1.1 实验细胞株46
• 3.1.2 实验仪器与设备46-47
• 3.1.3 实验试剂47-48
• 3.1.4 相关溶液的配制48-51
• 3.2 实验方法51-56
• 3.2.1 平板克隆实验51
• 3.2.2 Western Blot检测51-55
• 3.2.3 细胞凋亡检测55
• 3.2.4 Hoechst 33258染色55-56
• 3.3 实验结果56-64
• 3.3.1 化合物38对MGC-803克隆形成的抑制作用56-57
• 3.3.2 化合物38对MGC-803的迁移、侵袭的抑制作用57-58
• 3.3.3 化合物38抑制EMT的作用机制研究58-61
• 3.3.4 化合物38对MGC-803细胞凋亡的影响61-62
• 3.3.5 化合物38对MGC-803细胞凋亡相关蛋白的影响62-64
• 3.4 实验讨论64-66
• 小结66
• 参考文献66-69
• 4 化合物38的抗血管生成作用机制研究69-83
• 引言69-70
• 4.1 实验材料与方法70-71
• 4.1.1 实验细胞株70
• 4.1.2 实验仪器与设备70
• 4.1.3 实验试剂70
• 4.1.4 相关溶液的配制70-71
• 4.2 实验方法71-73
• 4.2.1 小管形成实验71
• 4.2.2 鸡胚尿囊膜实验71-73
• 4.3 实验结果73-79
• 4.3.1 化合物38对HUVEC的增殖抑制作用73-74
• 4.3.2 化合物38对HUVEC的迁移、侵袭的抑制作用74-75
• 4.3.3 化合物38抑制HUVEC的小管形成75-76
• 4.3.4 化合物38体内抑制血管形成76-77
• 4.3.5 化合物38对HUVEC血管生成相关蛋白的影响77-78
• 4.3.6 化合物38诱导HUVEC的细胞凋亡78-79
• 4.4 实验讨论79-81
• 小结81
• 参考文献81-83
• 结论83-84
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果84-86
• 个人简历84
• 攻读硕士期间已发表的论文和申请的专利84-85
• 会议论文85
• 荣誉与奖励85-86
• 致谢86

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