新福林和贝特舒对人角膜基质细胞凋亡诱导作用的实验研究

发布时间：2017-10-21 12:38

  本文关键词：新福林和贝特舒对人角膜基质细胞凋亡诱导作用的实验研究

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【摘要】：随着全球人口老龄化进程的加剧,受到青光眼等眼部疾病困扰的患者越来越多,其相应的治疗药物在眼科临床中得到了广泛应用。而眼表直接给药的方式易导致药物被角膜吸收而引起角膜损伤,主要是通过作用于角膜细胞引起的。人角膜基质细胞(Human corneal stromal cells,HCS细胞)在靠近前弹力层处分布较多,对维持角膜的正常结构和生理功能起关键作用,因此研究眼科药物对HCS细胞的影响作用对眼科药物的临床安全应用、低毒药物筛选体系的建立以及新型无毒眼科药物的研发具有重要的应用价值和科学意义。截止到目前,关于扩瞳用拟肾上腺素药新福林和治疗青光眼用抗肾上腺素药贝特舒对HCS细胞的毒性作用尚未见报道,本文以本实验室自建的非转染无致瘤性HCS细胞系为体外研究体系对新福林和贝特舒的凋亡诱导作用及其细胞与分子机理进行研究。为了研究新福林对HCS细胞的毒性影响、凋亡诱导作用及其细胞与分子机理,本文将临床浓度为100 g/L的新福林经倍比稀释至0.78125 g/L作用于HCS细胞,通过光镜观察、细胞活力和细胞周期检测观察其对HCS细胞的影响,光镜观察结果显示浓度高于0.78125 g/L的新福林可导致HCS细胞出现细胞皱缩、胞质空泡化、生长增殖异常等变化并呈现浓度和时间依赖性,细胞活力检测结果表明浓度高于1.5625 g/L的新福林均可引起HCS细胞的细胞活力下降,细胞周期检测结果表明6.25 g/L的新福林引起HCS细胞发生S期阻滞,这说明了新福林对HCS细胞具有毒性作用。细胞活力下降和细胞周期受阻均与细胞凋亡有密切联系,为了检测新福林对HCS细胞的毒性作用是否引起HCS细胞的凋亡,本文对其质膜通透性变化、磷脂酰丝氨酸外翻、DNA断片化和超微结构进行了检测,质膜通透性检测结果显示浓度高于3.125 g/L的新福林均对质膜通透性产生了显著影响,6.25 g/L的新福林可导致HCS细胞发生磷脂酰丝氨酸外翻和DNA断片化,且伴随胞质空炮化、核固缩、染色质凝集、凋亡小体等典型凋亡结构特征出现,说明了新福林对HCS细胞确实具有凋亡诱导作用。细胞凋亡可以通过几个途径起作用且有很多凋亡蛋白的参与,为了进一步研究新福林引起HCS细胞凋亡的细胞与分子机理,本文对6.25 g/L新福林处理的HCS细胞进行了Bcl-2家族蛋白的表达、线粒体膜电位和Caspase-3,8,9活性的检测。Bcl-2家族蛋白的检测显示新福林引起HCS细胞促凋亡蛋白Bad和Bax表达升高而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表达下降,线粒体膜电位发生去极化,且Caspase-8,9,3活性先后均增大,揭示新福林通过线粒体途径和死亡受体途径共同作用调控HCS细胞的凋亡。为了研究贝特舒对HCS细胞的毒性影响、凋亡诱导作用及其细胞与分子机理,本文将临床浓度为2.8 g/L的贝特舒经倍比稀释至0.04375 g/L作用于HCS细胞,光镜观察结果显示浓度高于0.0875g/L的贝特舒可导致HCS细胞出现细胞皱缩、胞质空泡化、生长增殖异常等变化并呈现浓度和时间依赖性,细胞活力检测结果表明浓度高于0.0875 g/L的贝特舒均可引起HCS细胞的细胞活力下降,细胞周期检测结果表明0.7 g/L的贝特舒引起HCS细胞发生G1期阻滞,这说明了贝特舒对HCS细胞具有毒性作用。进一步研究其凋亡诱导作用,质膜通透性检测结果显示浓度高于0.0875 g/L的贝特舒均对质膜通透性产生了显著影响,6.25 g/L的贝特舒可导致HCS细胞发生磷脂酰丝氨酸外翻和DNA断片化,且伴随胞质空炮化、核固缩、染色质凝集、凋亡小体等典型凋亡结构特征出现,说明了贝特舒对HCS细胞确实具有凋亡诱导作用。Bcl-2家族蛋白的检测显示贝特舒引起HCS细胞促凋亡蛋白Bad和Bax表达升高而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表达下降,线粒体膜电位发生去极化,且Caspase-9,3活性先后均增大,揭示贝特舒对HCS细胞的凋亡诱导作用具有线粒体依赖性。综上所述,在人角膜基质细胞系的体系中新福林和贝特舒均具有显著的凋亡诱导作用,且具有浓度和时间依赖性,新福林是通过线粒体途径和死亡受体途径的共同作用实现的,贝特舒是通过线粒体途径实现的。临床上应谨慎使用新福林和贝特舒,避免长期重复使用。
【关键词】：新福林 贝特舒 人角膜基质细胞 细胞凋亡
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文献综述13-27
• 1 青光眼13-14
• 1.1 青光眼和高眼压13
• 1.2 青光眼和高眼压的药物治疗13-14
• 1.3 散瞳剂的应用14
• 2 拟肾上腺素药新福林和抗肾上腺素药贝特舒14-19
• 2.1 拟肾上腺素药新福林15-18
• 2.1.1 新福林眼部应用的作用机理15-16
• 2.1.2 新福林在眼科中的应用16-17
• 2.1.3 新福林眼局部应用的不良反应17-18
• 2.2 抗肾上腺素药贝特舒18-19
• 2.2.1 贝特舒眼部应用的作用机理18-19
• 2.2.2 贝特舒在眼科中的应用19
• 2.2.3 贝特舒眼局部应用的不良反应19
• 3 细胞凋亡概述19-26
• 3.1 细胞凋亡的途径19-23
• 3.1.1 死亡受体途径20-21
• 3.1.2 线粒体途径21-22
• 3.1.3 内质网途径22
• 3.1.4 胱冬肽酶非依赖性途径22-23
• 3.2 细胞凋亡的过程及特征23
• 3.2.1 细胞凋亡的过程及形态学特征23
• 3.2.2 细胞凋亡的生化特征23
• 3.3 细胞凋亡的检测23-26
• 3.3.1 形态学观察24
• 3.3.2 质膜通透性检测24
• 3.3.3 DNA降解分析24-25
• 3.3.4 DNA原位缺口末端标记法(TUNEL)25
• 3.3.5 细胞凋亡相关蛋白检测25-26
• 4 本文的目的及意义26-27
• 第二章 新福林对人角膜基质细胞的凋亡诱导作用研究27-51
• 1 实验材料与用品27-30
• 1.1 实验材料27
• 1.2 实验药品27-28
• 1.3 实验仪器28-29
• 1.4 几种主要溶液的配方29-30
• 2 实验方法30-36
• 2.1 实验前的准备30-31
• 2.1.1 人角膜基质细胞的体外培养30
• 2.1.2 人角膜基质细胞的收获、传代和接板30-31
• 2.1.3 倍比稀释法得不同浓度新福林31
• 2.2 不同浓度新福林处理HCS细胞的实验方法31-36
• 2.2.1 用不同浓度新福林处理HCS细胞的形态学观察31-32
• 2.2.2 用不同浓度新福林处理HCS细胞的MTT检测32
• 2.2.3 新福林处理HCS细胞的细胞周期检测32-33
• 2.2.4 用不同浓度新福林处理HCS细胞的AO/EB荧光双染色33
• 2.2.5 新福林处理HCS细胞的磷脂酰丝氨酸的质膜定位检测33-34
• 2.2.6 新福林处理HCS细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳34
• 2.2.7 新福林处理HCS细胞的透射电镜检测34
• 2.2.8 新福林处理HCS细胞的Bcl-2家族蛋白检测34-35
• 2.2.9 新福林处理HCS细胞的线粒体膜电位检测35
• 2.2.10 新福林处理HCS细胞的Caspase活性检测35-36
• 2.3 统计学分析36
• 3 实验结果36-46
• 3.1 不同浓度新福林处理HCS细胞的形态学变化36-38
• 3.2 不同浓度新福林处理HCS细胞的MTT检测38-39
• 3.3 新福林处理HCS细胞的细胞周期检测39-40
• 3.4 新福林处理HCS细胞的磷脂酰丝氨酸的质膜定位检测40-41
• 3.5 新福林处理HCS细胞的DNA断片化41-42
• 3.6 不同浓度新福林处理HCS细胞的超微结构变化42-43
• 3.7 新福林处理HCS细胞的线粒体膜电位检测43-44
• 3.8 新福林处理HCS细胞的Bcl-2家族蛋白检测44-45
• 3.9 新福林处理HCS细胞的线粒体膜电位检测45-46
• 3.10 新福林处理HCS细胞的Caspase活性检测46
• 4 讨论46-49
• 5 结论49-51
• 第三章 贝特舒对人角膜基质细胞的凋亡诱导作用研究51-70
• 1 实验材料与用品51-52
• 1.1 实验材料51
• 1.2 实验药品51
• 1.3 实验仪器51
• 1.4 几种主要溶液的配方51-52
• 2 实验方法52-55
• 2.1 实验前的准备52
• 2.1.1 人角膜基质细胞的体外培养52
• 2.1.2 人角膜基质细胞的收获、传代和接板52
• 2.1.3 倍比稀释法得不同浓度贝特舒52
• 2.2 不同浓度贝特舒处理HCS细胞的实验方法52-55
• 2.2.1 用不同浓度贝特舒处理HCS细胞的形态学观察52
• 2.2.2 用不同浓度贝特舒处理HCS细胞的MTT检测52-53
• 2.2.3 贝特舒处理HCS细胞的细胞周期检测53
• 2.2.4 用不同浓度贝特舒处理HCS细胞的AO/EB荧光双染色53
• 2.2.5 贝特舒处理HCS细胞的磷脂酰丝氨酸的质膜定位检测53-54
• 2.2.6 贝特舒处理HCS细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳54
• 2.2.7 贝特舒处理HCS细胞的透射电镜检测54
• 2.2.8 贝特舒处理HCS细胞的Bcl-2家族蛋白检测54
• 2.2.9 贝特舒处理HCS细胞的线粒体膜电位检测54-55
• 2.2.10 贝特舒处理HCS细胞的Caspase活性检测55
• 2.3 统计学分析55
• 3 实验结果55-66
• 3.1 不同浓度贝特舒处理HCS细胞的形态学变化55-58
• 3.2 不同浓度贝特舒处理HCS细胞的MTT检测58-59
• 3.3 贝特舒处理HCS细胞的细胞周期检测59-60
• 3.4 不同浓度贝特舒处理HCS细胞的质膜通透性变化60-61
• 3.5 贝特舒处理HCS细胞的磷脂酰丝氨酸的质膜定位检测61-62
• 3.6 贝特舒处理HCS细胞的DNA断片化62-63
• 3.7 不同浓度贝特舒处理HCS细胞的超微结构变化63-64
• 3.8 贝特舒处理HCS细胞的Bcl-2家族蛋白检测64-65
• 3.9 贝特舒处理HCS细胞的线粒体膜电位检测65-66
• 3.10 贝特舒处理HCS细胞的Caspase活性检测66
• 4 讨论66-68
• 5 结论68-70
• 全文总结70-71
• 参考文献71-79
• 致谢79-80
• 个人简历80-81
• 在学期间发表的学术论文及专利81

【参考文献】

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本文编号：1073433