EGFR受体介导肺肿瘤靶向siRNA脂多胺修饰脂质体的体内动态与药效学评价

发布时间：2017-10-22 00:07

  本文关键词：EGFR受体介导肺肿瘤靶向siRNA脂多胺修饰脂质体的体内动态与药效学评价

  更多相关文章： EGFR受体 survivin-siRNA MRP1-siRNA 荷正电类脂质 肺部吸入

【摘要】：目的：构建EGFR受体介导肺肿瘤靶向survivin siRNA和MRP1 siRNA共负载脂多胺修饰脂质体(EGFR-PEG-NCLs-siRNA),评价其制剂学性质、细胞内动态、体内组织分布以及与顺铂联合用药的抗肿瘤效果。方法：首先,通过置换和酰胺化反应合成类脂质阳离子载体材料N,N'-二油酰三羟甲基氨基甲烷(2-氨基乙基)胺(N,N'-dioleoyl tris (2-aminoethyl) amine, NDOA),并合成聚乙二醇(PEG)马来酸嫁接二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DEPE)。通过硅胶薄层色谱法(TLC)、傅里叶红外光谱法(FT-IR)和核磁共振法(1H-NMR)等对上述合成产物进行结构验证。采用乙醇注入法制备阳离子脂质体,并测定其粒径,Zeta电位和FAM-siRNA的包封率。以人源非小细胞肺腺癌A549细胞和耐顺铂株A549/DDP细胞为模型,以MTT法考察空白长循环阳离子脂质体(PEG-NCLs)对A549与A549/DDP细胞的安全性。采用流式细胞仪(Flow Cytometry, FCM)和激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope, CLSM)考察A549/DDP细胞对EGFR-PEG-NCLs的摄取及其从A549/DDP细胞溶酶体中的逃逸。采用FCM考察EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA对A549/DDP细胞的凋亡。采用荧光实时定量PCR(RT-PCR)考察EGFR-PEG-NCLs-survivin/MRP1 siRNA对A549细胞的基因沉默。喷雾冷冻干燥法将脂质体制成微粉供肺部干粉吸入给药。以带绿色荧光的人源性肺腺癌细胞株Luc-A549建立裸鼠原位肺癌模型,用小动物活体成像仪考察负载siRNA的脂质体通过肺部吸入与尾静脉注射给药时在体内各组织器官分布情况；并考察负载survivin siRNA和MRP1 siRNA的脂质体与顺铂联用时抑制肿瘤生长的效果。最后,通过苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining, HE)考察给药对各组织器官的影响。结果：经TLC,1H-NMR和FT-IR法验证了阳离子载体材料NDOA的成功制备,其纯度为87%；DSPE-PEG2000-Mal经TLC和1H-NMR法验证产物合成,其纯度为86.2%。PEG-NCLs的粒径为(193.2±3.4)nm,Zeta-电位为(7.9 ± 0.1)mV, FAM-siRNA的包封率为(91.9±0.8)%。TEM图结果显示,所制得脂质体粒度均匀,颗粒圆整,分散性良好。摄取结果表明,EGFR靶向可以明显提高A549/DDP细胞对PEG-NCLs的摄取能力,其摄取能力是未经EGFR修饰的1.4倍。CLSM结果显示,EGFR-PEG-NCLs-siRNA可从A549/DDP细胞的溶酶体中成功逃逸EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA组的凋亡率为(41.14±1.68)%,约为Lipofectamine-2000组(19.86±1.30)%的2倍。EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA的基因沉默率为(96.7±1.2)%,EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA的基因沉默率为(50.0±16.1)%,均有良好的基因沉默效果。此外,EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA和EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA转染进A549细胞后,A549细胞对顺铂的敏感性提高。体内组织分布结果显示,脂质体通过肺部吸入相对于尾静脉注射在肺部停留时间久,并且靶向性较好。抑瘤实验结果表明,顺铂(DDP)与EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA与EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA联合给药具有明显的抑制肿瘤生长的作用。HE染色结果表明,DDP与EGFR-PEG-NCLs-survivin siRNA与EGFR-PEG-NCLs-MRP1 siRNA联合给药对肿瘤的杀伤能力最强,且不会对各组织器官造成损伤,安全性较好。结论：本文制备的EGFR受体介导肺肿瘤靶向siRNA脂多修饰脂质体(EGFR-PEG-NCLs-siRNA)粒径均一,颗粒圆整,分散性和稳定性较好,EGFR靶向显著提高细胞摄取率,并且可以成功的从溶酶体中逃逸出来。它能很好地转运siRNA,与顺铂联合用药可以发挥良好的体内外杀伤非小细胞肺癌A549细胞作用。
【关键词】：EGFR受体 survivin-siRNA MRP1-siRNA 荷正电类脂质 肺部吸入
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文献综述12-19
• 1 RNA干扰12-14
• 1.1 RNA干扰的起源12
• 1.2 siRNA在肺部递送的障碍12-14
• 2 SIRNA在治疗肺部疾病的给药途径14-15
• 3 肺部疾病模型15-16
• 4 临床研究进展16-17
• 5 展望17
• 6 本研究的立题依据和目的17-19
• 第二章 阳离子脂质材料NDOA的合成及表征19-28
• 1 实验材料和仪器19-20
• 1.1 实验材料19
• 1.2 实验仪器19-20
• 2 实验方法20-22
• 2.1 NDOA的合成20-21
• 2.2 DSPE-PEG_(2000)-Mal的合成21-22
• 3 实验结果与讨论22-27
• 3.1 油酸三氟乙酯的表征22-24
• 3.2 NDOA的表征24-26
• 3.3 DSPE-PEG_(2000)-Mal的表征26-27
• 4 本章小结27-28
• 第三章 EGFR受体介导肺肿瘤靶向siRNA脂质体的制备28-34
• 1 实验材料和仪器28-29
• 1.1 实验材料28
• 1.2 实验仪器28-29
• 2 溶液配制29
• 3 实验方法29-31
• 3.1 FAM-siRNA标准曲线的绘制29
• 3.2 PEG修饰的阳离子脂质体的制备29
• 3.3 Anti-EGFR mAb的巯基化29-30
• 3.4 EGFR靶向负载siRNA的脂质体的制备30
• 3.5 粒径及电位的测定30
• 3.6 脂质体的表征30
• 3.7 包封率的测定30
• 3.8 负载siRNA脂质体的N/P30-31
• 4 实验结果与讨论31-33
• 4.1 FAM-siRNA的标准曲线31
• 4.2 脂质体的制备与表征31-33
• 5 本章小结33-34
• 第四章 阳离子脂质体细胞摄取、定位及药效学评价34-50
• 1 实验材料和仪器34-35
• 1.1 实验材料34-35
• 1.2 实验仪器35
• 2 溶液配制35
• 3 实验方法35-39
• 3.1 细胞培养35
• 3.2 细胞毒性35-36
• 3.3 细胞摄取36-37
• 3.4 溶酶体逃逸37
• 3.5 细胞凋亡37
• 3.6 RT-PCR检测survivin基因和MRP1基因mRNA的表达37-38
• 3.7 体外药效学评价38-39
• 3.8 数据的分析39
• 4 实验结果39-49
• 4.1 细胞毒性39-40
• 4.2 细胞摄取40-42
• 4.3 溶酶体逃逸42-43
• 4.5 细胞凋亡43-45
• 4.6 RT-PCR测定survivin基因和MRP1基因中mRNA的表达45-46
• 4.7 细胞药效学评价46-49
• 5 本章小结49-50
• 第五章 EGFR-PEG-NCLS-ICG干粉吸入剂的制备与评价50-56
• 1 实验材料与仪器50
• 1.1 实验材料50
• 1.2 实验仪器50
• 2 实验方法50-52
• 2.1 EGFR-PEG-NCLs-ICG干粉吸入剂的制备50-51
• 2.2 粉末形态51
• 2.3 X-射线衍射51
• 2.4 引湿性51
• 2.5 排空率51
• 2.6 体内组织分布51-52
• 3 实验结果与讨论52-55
• 3.1 微粉的粒度分布52
• 3.2 粉末形态52-53
• 3.3 X-射线衍射53-54
• 3.4 排空率54
• 3.5 引湿性54-55
• 3.6 体内组织分布55
• 4. 本章小结55-56
• 第六章 EGFR受体介导肺肿瘤靶向siRNA脂多胺修饰脂质体的体内评价56-65
• 1 实验材料与仪器56-57
• 1.1 实验材料56
• 1.2 实验仪器56-57
• 1.3 实验动物57
• 2 溶液配制57
• 3 实验方法57-58
• 3.1 肺癌原位模型的建立57
• 3.2 肺癌原位模型的活体荧光成像57
• 3.3 肺癌原位模型离体器官成像及组织分布研究57-58
• 3.4 体内药效学评价58
• 3.5 离体组织H&E染色58
• 3.6 数据的分析58
• 4 实验结果与讨论58-64
• 4.1 近红外荧光成像58-60
• 4.2 离体组织分布60-62
• 4.3 抗肿瘤效果62-63
• 4.4 离体组织H&E染色63-64
• 5 小结64-65
• 全文总结65-66
• 参考文献66-73
• 致谢73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 秦宏阳;罗玉均;张得玉;冯春复;何逸民;张桂红;;2型猪圆环病毒感染对小鼠组织中Caspase3、Bak及Bcl-2基因表达的影响[J];中国预防兽医学报;2009年05期

，

本文编号：1075845