重组人干扰素α-2b的新型制备方法及其长效制剂研究

发布时间：2017-10-23 08:43

  本文关键词：重组人干扰素α-2b的新型制备方法及其长效制剂研究

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【摘要】：干扰素是单核细胞分泌的具有高活性、多生物功能的细胞因子。自从1957年IFN被发现至今,对IFN的研究和产品研发一直在持续。干扰素在抗病毒、抗肿瘤以及在免疫调节中起到至关重要的作用。IFNα-2b是IFN大家族中最早被发现的亚型之一;也是临床治疗中应用最广泛的品种之一,在众多类型的干扰素中,IFNα-2b的抗病毒、抗肿瘤、机体免疫调节能力最强,因此,IFNα-2b在多种疾病治疗中发挥不可替代的作用。目前,大多数医药生产企业的IFNα-2b制备方式仍沿用包涵体变复性的形式,尽管,随着生产水平的提高其复性率有所增加,但产品中依然残存无活性的错配体,导致产品活性较低,药品质量存在严重缺陷。拥有诸多生物活性的rhIFN,在临床应用中有着极其重要地位,尤其是在乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾病和卡波其肉瘤、恶性黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤等癌症治疗中起到重要作用,但rhIFN也存在其他生物药剂的通病:即副作用大;半衰期短;容易产生中和抗体等弊端。因此,对它进行结构改造和修饰的研究仍在继续。长效干扰素作为干扰素的衍化产物,是利用点击化学的理论,通过有机化学中各种反应,使干扰素中游离的基团与无毒无害无刺激的PEG进行偶联得到的复合产物。偶联后的长效干扰素拥有干扰素的众多优点,并且具有更大的分子量,更长半衰期;尽管PEG的加入使得干扰素的生物学活性有所降低,但降低了它的副作用并减少了中和抗体的产生。本实验针对干扰素IFNα-2b在原核生物中只能以包涵体形式表达的现状,利用基因工程将其进行改造,添加分子伴侣TrxA、Smt3等,使其能够达到可溶性表达的目的,并利用简便的纯化技术,使用高效SUMO酶等试剂将其提纯。对纯化的干扰素蛋白使用单甲氧基化的mPEG-SPA20000进行定点修饰。以极其简便的纯化步骤及方式将单偶联聚乙二醇的干扰素mPEG-IFNα-2b提纯出来。最后,利用高压液相色谱以及体外活性实验对其纯度及生物活性进行检验。实验内容I:利用多分子伴侣表达载体在大肠埃希氏菌中融合表达人干扰素IFNα-2b,并进行IFNα-2b纯化工艺的研究;使用细菌培养、质粒提取、质粒酶切与连接、菌体诱导表达、蛋白纯化等技术,将人工设计并合成Smt3-IFNα-2b克隆至自行构建的P32-TrxA载体中,将重组表达质粒P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b转化至大肠埃希氏菌(E.coil)BL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析,表明IFNα-2b呈可溶性表达形式存在,在此基础之上再利用诸多层析方法:MCAC技术、SUMO蛋白酶酶切、IEC技术以及GFC层析技术等提纯了干扰素IFNα-2b,并建立了以IFNα-2b可溶性表达形式为基础的全新制备工艺。实验内容II:利用第二代聚乙二醇对IFN的定点修饰的特点,在反应中得到单聚乙二醇修饰的长效干扰素,并进行mPEG-IFNα-2b纯化工艺的探索;根据对本实验中涉及的干扰素IFNα-2b、聚乙二醇性质的报道的研究,选用mPEG-SPA20000对其进行偶联,使用生物学统计软件,对聚乙二醇与干扰素偶联实验条件进行5因素4水平的正交试验设计,选取最佳的偶联反应条件,进行试验。通过使用各种层析方式,如:MCAC技术、AC技术、以及GFC技术,获得了纯度高、生物活性较好的单聚乙二醇偶联的干扰素mPEG-IFNα-2b,形成了较系统的mPEG-IFNα-2b纯化工艺。实验内容III:利用干扰素及长效干扰素的抗病毒、抗肿瘤特性,对人羊膜细胞及各种肿瘤细胞进行体外生物活性研究;使用Lowry试剂法及BSA试剂法测定两种蛋白浓度,使用高效液相色谱对两种干扰素进行纯度测定,并且使用含10%FBS的RPMI1640和10%FBS的DMEM透析后过滤除菌,依照《中华人民共和国药典》(2015版)对其进行细胞病变抑制实验,测得两种干扰素的抗病毒活性,并通过体外细胞实验,检测两种干扰素对不同肿瘤细胞的抑制和杀灭效果。
【关键词】：干扰素 长效干扰素 蛋白纯化 定点修饰 高效液相色谱
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-11
• 第一篇 文献综述11-22
• 第一章 干扰素11-17
• 1.1 干扰素的定义及发展史11-12
• 1.2 干扰素的种类12
• 1.3 干扰素的结构12
• 1.4 干扰素的理化性质12-13
• 1.5 干扰素的生物活性13-14
• 1.5.1 抗病毒13-14
• 1.5.2 抗肿瘤14
• 1.6 干扰素IFNα-2b14-16
• 1.7 临床医疗中应用16
• 1.8 干扰素优点及不足16-17
• 第二章 长效干扰素17-22
• 2.1 长效干扰素种类17
• 2.2 点击化学17
• 2.3 mPEG和mPEG-SPA2000017-18
• 2.4 长效干扰素mPEG-IFN18-19
• 2.5 长效干扰素的理化性质及生物活性19
• 2.6 临床中的应用及发展前景19-22
• 第二篇 研究内容22-49
• 第一章 P32-TrxA- Smt3-IFNα-2b基因构建表达及纯化22-32
• 1.1 试验材料22-24
• 1.1.1 仪器22
• 1.1.2 主要试剂22-23
• 1.1.3 预溶液的配制23-24
• 1.2 试验方法24-27
• 1.2.1 重组P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b质粒的构建24-25
• 1.2.2 工程菌P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b/ BL21（DE3）的制备与诱导表达25-26
• 1.2.3 融合蛋白P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b的纯化26
• 1.2.4 重组人干扰素IFNα-2b的纯度检测26-27
• 1.3 结果27-31
• 1.3.1 P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b基因片段的酶切与回收27
• 1.3.2 重组载体P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b的酶切鉴定27-28
• 1.3.3 融合蛋白TrxA-Smt3-IFNα-2b的表达28
• 1.3.4 融合蛋白TrxA-Smt3-IFNα-2b的粗纯化28-30
• 1.3.5 融合蛋白的精度纯化30
• 1.3.6 高效液相色谱浓度鉴定30-31
• 1.4 讨论31
• 1.5 小结31-32
• 第二章 长效干扰素mPEG-IFNα-2b制备32-41
• 2.1 实验材料32-33
• 2.1.1 主要仪器32
• 2.1.2 主要试剂32-33
• 2.1.3 试剂配制33
• 2.2 实验方案33-36
• 2.2.1 长效干扰素mPEG-IFNα-2b的制备33-34
• 2.2.2 单甲基化的长效干扰素mPEG-IFNα-2b的纯化34-35
• 2.2.3 单甲基化的长效干扰素mPEG-IFNα-2b纯度检测35-36
• 2.3 结果36-39
• 2.3.1 长效干扰素mPEG-IFNα-2b正交试验结果36-38
• 2.3.2 单甲基化的长效干扰素mPEG-IFNα-2b的纯化38-39
• 2.3.3 长效干扰素mPEG-IFNα-2b的反向高效液相色谱39
• 2.4 讨论39-40
• 2.5 小结40-41
• 第三章 两种干扰素的体外生物活性的研究41-49
• 3.1 试验材料41-42
• 3.1.1 材料41
• 3.1.2 主要仪器41
• 3.1.3 主要试剂41-42
• 3.2 试验方法42-45
• 3.2.1 细胞复苏42
• 3.2.2 细胞铺板42-43
• 3.2.3 两种干扰素的体外抗肿瘤细胞实验43
• 3.2.4 两种干扰素的体外抗病毒实验43-45
• 3.3 结果45-47
• 3.3.1 两种干扰素作用于Hela细胞效果45
• 3.3.2 两种干扰素作用于Hep-2 细胞效果45-46
• 3.3.3 两种干扰素作用于Ishikawa细胞效果46
• 3.3.4 两种干扰素作用于BGC细胞效果46
• 3.3.5 两种干扰素作用于Wish细胞效果46-47
• 3.3.6 两种干扰素作用于 Wish-VSV 系统蛋白效价47
• 3.4 讨论47-48
• 3.5 小结48-49
• 结论49-50
• 参考文献50-55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 杨宇峰;路煜;石玮;马相虎;秦洁;朱威;楼觉人;;聚乙二醇修饰重组人干扰素α1b的制备及其性质[J];中国生物制品学杂志;2010年06期

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本文编号：1082463