具有抗真菌活性的光亲和标记探针的设计、合成及其功能研究

发布时间：2017-10-27 13:14

  本文关键词：具有抗真菌活性的光亲和标记探针的设计、合成及其功能研究

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【摘要】：近二十年来,深部真菌感染的发生率及死亡率呈快速增长趋势,而目前临床上常用的抗真菌药物存在疗效有限、毒副作用大、抗菌谱窄和易产生耐药性等问题,其中真菌的耐药性成为深部侵袭性真菌感染治疗失败的主要原因。我们前期已经发现小檗碱、连翘酯苷A、芒果苷、黄芩素等天然小分子化合物都具有协同氟康唑抗耐药真菌活性,与氟康唑联合应用,能显著提高氟康唑的抗耐药真菌活性,而且他们有相近的体内外药效,相似的药效基团,但由于作用机制不清,作用靶点不明,严重阻碍了以此为基础的新型抗真菌药物研究。此外,两药协同抗耐药真菌过程中,氮唑类抗真菌药物的分布和外排有待进一步的研究与确证。光亲和标记(PAL)技术是用于确证、分离和表征新型生物分子及潜在药物靶点的有效和可靠工具,特别用于未知靶点的发现。因此,我们采用PAL-CC-ABPPC(Photoaffinity labeling chck chemistry activity-based protein profiling)技术将上述化合物做成光亲和探针,为后期运用生物正交技术、生物信息学技术、基因组学技术研究药物靶点奠定基础。在前期针对小檗碱类探针分子进行的靶点探测的研究基础上,本课题基于光亲和标记技术对另一类协同抗真菌剂黄芩素及氮唑类抗真菌药物进行探针化设计合成,并对其应用做了初步研究：(1)设计合成三氟甲基苯基二氮杂环丙烯类光亲和标记基团中间体TPD-6,TPD-6a, TPD-6b, TPD-10a, TPD-lOb, TPD-10c, TPD-A, TSL-7,并通过NMR, MS确认其结构。(2)以具有协同氟康唑抗耐药真菌活性的黄芩素为活性基团、三氟甲基苯基二氮杂环丙烯为光亲和标记基团、苄溴为反应基团、丙炔基团为潜在的报告基团,设计、合成了探针分子BE-1、BE-2、BE-4、BE-5、BE-6,并通过NMR, MS确认其结构。活性测试结果表明,BE-2与氟康唑(1μg/ml联用,对耐药白念珠菌(103)的MIC80为4μg/ml,两药合用的FICI值为0.039。BE-5与氟康唑(0.25μg/ml)联用的MIC80为8μg/ml,两药合用的FICI值为0.065,表明BE-2及BE-5都有较好的协同氟康唑抗耐药白念珠菌活性,可作为活性探针用于后续研究。(3)利用近几年报道的带有活性卡宾及香豆素前体的新型原位标签生成的探针技术,设计合成了BE-3,通过NMR、MS确认其结构,活性测试结果与BE-2相当,其与氟康唑(1 μg/ml)联用对耐药白念珠菌(103)的MIC80为4μg/ml,两药合用的FICI值为0.039,证明其为活性探针。(4)以三氟甲基苯基二氮杂环丙烯为光亲和标记基团,以三氮唑类抗真菌活性类似物为母体,设计合成了氮唑类小分子探针FCZ-GB, FCZ-1、FCZ-2、FCZ-3、FCZ-4,并进行了体外抗真菌活性测试,测得FCZ-GB、FCZ-3、FCZ-4对白念珠菌(Y0109)的MIC80值分别为：0.25μg/ml、4μg/ml、0.5μg/ml,可作为活性的氮唑类抗真菌药物探针。为了对设计合成的探针分子的功能进行初步的评估,我们首先将BE-2探针分子与白念珠菌的全蛋白提取液进行蛋白结合的初步研究。SDS-PAGE结果显示,蛋白出现特异性条带,证实了BE-2具有蛋白结合功能和与荧光分子成像示踪动能,具备用于后续靶点研究的可行性。将出现的特异性条带作初步的质谱分析,结果显示半胱氨酸或赖氨酸可能为BE-2结合在靶蛋白上的氨基酸残基。以上实验为BE-3及BE-5的应用奠定基础。另外,FCZ-GB用以进行结合靶蛋白的质谱分析,对于FCZ-3及FCZ-4可结合光亲和标记及生物正交成像技术做下一步的靶点信息探测。本课题设计合成了具有协同氟康唑抗耐药真菌活性的黄芩素类光亲和探针和具有抗真菌活性的氮唑类光亲和探针,为两类化合物的系统抗耐药机制和作用靶点研究奠定基础。
【关键词】：协同 抗真菌 光亲和标记 靶点 探针
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914;R91
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-12
• 第一章 前言12-18
• 1 抗耐药真菌药物研究现状12-15
• 2 基于光亲和标记的小分子探针技术15-18
• 第二章 课题设计18-23
• 第三章 化学实验23-49
• 1 试剂与仪器23
• 1.1 溶剂与原料23
• 1.2 分析检测仪器及检测条件23
• 2. 光亲和标记小分子探针的设计合成23-49
• 2.1 光亲和片段的合成23-30
• 2.1.1 关键中间体TPD-6,TPD-6a,TPD-6b的合成23-25
• 2.1.2 化合物TPD-10a的合成25-26
• 2.1.3 化合物TPD-10b的合成26-27
• 2.1.4 化合物TPD-10c的合成27-28
• 2.1.5 化合物TPD-A的合成28-29
• 2.1.6 化合物TSL-7的合成29-30
• 2.2 目标探针分子的合成30-37
• 2.2.1 黄芩素类探针BE-1,BB2的合成31-32
• 2.2.2 黄芩素类探针BE-3的合成32
• 2.2.3 黄芩素类探针BE-4,BE-5的合成32
• 2.2.4 黄芩素类探针BE-6的合成32-33
• 2.2.5 氮唑类探针FCZ-GB的合成33-34
• 2.2.6 氮唑类探针FCZ-1的合成34
• 2.2.7 氮唑类探针FCZ-2的合成34-35
• 2.2.8 氮唑类探针FCZ-3的合成35-36
• 2.2.9 氮唑类探针FCZ-4的合成36-37
• 2.3 药理实验中Click反应的体外验证37-38
• 2.4 药理实验中光解时间的体外验证38-43
• 2.5 部分化合物的结构与表征43-49
• 第四章 药理实验49-58
• 1 探针分子抗耐药白念珠菌作用活性测试49-53
• 1.1 实验材料49-50
• 1.2 实验方法50-51
• 1.3 实验结果51-53
• 2 小分子探针捕获靶点的初步研究53-58
• 2.1 实验材料53-54
• 2.2 实验方法54-55
• 2.3 实验结果55-58
• 第五章 小结与讨论58-62
• 参考文献62-65
• 附录65-80
• 致谢80-82
• 综述82-102
• 参考文献96-102
• 作者简历102-103

【参考文献】

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1 郭娜;呋喃喹啉类生物碱白鲜碱体外抗真菌活性及作用机制研究[D];吉林大学;2009年

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本文编号：1103631