间苯三酚类衍生物治疗帕金森氏病作用和机制的研究

发布时间：2017-10-29 18:16

  本文关键词：间苯三酚类衍生物治疗帕金森氏病作用和机制的研究

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【摘要】：第一部分：间苯三酚类衍生物对帕金森氏病模型的神经保护作用研究帕金森氏病(Parkinson's Disease,PD)是最常见的神经退行性疾病之一,主要病理特征为患者中脑多巴胺能神经元进行性变性死亡以及细胞内路易氏小体的形成,导致黑质-纹状体多巴胺能系统功能减退,从而使患者出现运动障碍。间苯三酚类衍生物WYD1-8和WYD7-6是由中国医学科学院药物研究所植化室合成得到的新型化合物,前期研究提示两个化合物均有较好的抑制炎症作用,相关内容已申请化合物专利保护。本研究在前期研究工作的基础上,采用经典的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine, MPTP)建立体内PD模型及经典致炎剂脂多糖(Lipopolysacchride,LPS)建立体外神经炎症模型,进一步考察WYD1-8和WYD7-6的神经保护及抑制神经炎症作用。体内采用小鼠腹腔注射MPTP致亚急性PD模型,考察WYD1-8和WYD7-6的神经保护作用。结果显示,化合物WYD1-8和WYD7-6均能明显改善MPTP致小鼠亚急性帕金森氏病的运动障碍,并对小鼠黑质内多巴胺能神经元具有较强的保护作用,提高小鼠纹状体内多巴胺(Dopamine, DA)含量。WYD1-8和WYD7-6可显著抑制黑质内小胶质细胞活化,减少炎症因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosis factor-α, TNF-α)的释放。应用LPS刺激原代中脑混合培养体系作为体外神经炎症模型,进一步考察WYD1-8和WYD7-6神经保护及抑制神经炎症作用。研究发现,化合物WYD1-8和WYD7-6能明显抑制LPS诱导的原代中脑混合培养体系中小胶质细胞活化,减少其活化标志物离子钙结合受体蛋白1 (Ionized calcium binding adapter molecule 1, Iba-1)表达及炎症因子IL-1β和TNF-α的释放。WYD1-8和WYD7-6能提高体系中酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)表达水平,保护多巴胺能神经元。本研究证实了WYD1-8和WYD7-6具有较强的神经保护和神经炎症抑制作用,其治疗PD作用与其抑制小胶质细胞过度活化剂保护多巴胺能神经元密切相关。本研究表明化合物WYD1-8和WYD7-6是具有良好前景的治疗PD的候选化合物。第二部分：间苯三酚类衍生物WYD7-6抑制神经炎症作用机制研究本论文第一部分研究结果表明,间苯三酚类衍生物WYD7-6神经保护作用与其抑制小胶质细胞活化介导的神经炎症相关。然而其抑制神经炎症的具体机制尚不十分清楚。因此本部分研究内容我们对其作用机制进行了初步探讨。应用蛋白质组学液质联用技术方法,对WYD7-6处理后的MPTP加丙磺舒致小鼠慢性PD模型中脑总蛋白进行分析比较。通过Western blot法验证以及查阅相关文献,我们重点考察了Akt信号通路的上游调控分子第十号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因编码蛋白(Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase and dual-specificity protein phosphatase, PTEN)及其相关信号通路。应用LPS刺激BV2小胶质细胞株作为神经炎症模型,首先考察PTEN与神经炎症的关系。研究发现,当小胶质细胞中的PTEN被抑制后,LPS引起的炎症通路激活以及炎症因子释放均增加,说明PTEN在调控神经炎症中发挥负性调控作用。PTEN的活性主要受到其上游磷酸酶的调控,蛋白质组学定量结果及Western blot验证结果显示,非受体酪氨酸蛋白激酶Src在不同处理组中脑中表达变化最明显,因此我们对Src激酶进行进一步研究。应用siRNA干扰技术干扰Src激酶的表达后,LPS引起的炎症反应减少,说明Src激酶参与炎症反应的发生。Src激酶表达降低后,LPS诱导的PTEN及Akt磷酸水平均降低,表明Src激酶对炎症的调节作用可能是通过对PTEN及Akt通路的调控来实现的。应用LPS刺激BV2作为神经炎症模型,考察WYD7-6对于Src/PTEN/Akt通路的影响。结果表明,WYD7-6可抑制Src激酶介导的炎症信号通路激活。在中脑原代培养体系中,干扰Src表达后,加入LPS、1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)以及α-突触核蛋白(a-synuclein)等刺激剂间接或直接损伤神经元,考察WYD7-6是否通过抑制Src激酶发挥神经保护作用。结果显示,干扰Src表达后,WYD7-6的神经保护作用被削弱,表明Src介导了WYD7-6抑制神经炎症的作用。体外应用c-Src激酶抑制剂筛选试剂盒检测WYD7-6对c-Src激酶的直接抑制作用,结果显示WYD7-6并不能直接抑制酶活性,表明Src激酶并不是WYD7-6的直接作用靶点,WYD7-6可能通过调节Src激酶上游蛋白分子从而抑制Src激酶及其下游信号通路的激活。本部分机制研究表明Src/PTEN/Akt信号通路在WYD7-6发挥抑制神经炎症作用中有重要作用。进一步机制研究表明WYD7-6并不直接作用于Src激酶,可能是通过其他上游调控蛋白发挥调控作用,需要进行进一步探索。
【关键词】：帕金森氏病 间苯三酚类衍生物 神经炎症 多巴胺能神经元 神经炎症 间苯三酚类衍生物 蛋白质组学 Src激酶 PTEN
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 英文缩略词表(Abbreviation)5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一部分：间苯三酚类衍生物对帕金森氏病模型的神经保护作用研究11-34
• 前言11-12
• 材料与方法12-21
• 实验结果21-29
• 1. WYD1-8和WYD7-6改善MPTP致小鼠PD模型的运动障碍21-23
• 2. WYD1-8和WYD7-6提高MPTP致小鼠PD模型纹状体内多巴胺含量23
• 3. WYD1-8和WYD7-6抑制MPTP致小鼠PD模型黑质内多巴胺能神经元损伤23-24
• 4. WYD1-8和WYD7-6降低MPTP致小鼠PD模型中脑内炎症因子含量24-25
• 5. WYD1-8和WYD7-6抑制LPS诱发原代中脑混合培养体系中小胶质细胞活化25-26
• 6. WYD1-8和WYD7-6降低LPS诱发原代中脑混合培养体系中炎症因子的释放26-27
• 7. WYD1-8和WYD7-6保护LPS诱发原代中脑混合培养体系中多巴胺能神经元损伤27-29
• 讨论29-31
• 小结31-32
• 参考文献32-34
• 第二部分：间苯三酚类衍生物WYD7-6抑制神经炎症作用机制研究34-55
• 前言34
• 材料与方法34-41
• 实验结果41-49
• 1. 差异蛋白质组学寻找WYD7-6抑制神经炎症的作用靶点41-43
• 2. PTEN抑制剂增加LPS诱导的Akt磷酸化水平及炎症因子TNF-α释放量43-44
• 3. 干扰Src激酶后降低LPS诱导的炎症因子TNF-α释放量44-45
• 4. 干扰Src激酶后降低LPS诱导的PTEN及Akt磷酸化45-46
• 5. WYD7-6抑制LPS诱导的Src/PTEN/Akt信号通路激活46-47
• 6. WYD7-6通过Src激酶发挥神经保护作用47-48
• 7. WYD7-6对c-Src酶活性直接无抑制作用48-49
• 讨论49-51
• 小结51-52
• 参考文献52-55
• 文献综述55-65
• 参考文献61-65
• 致谢65-67
• 个人简历67-68

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